Riassunto analitico
Questo lavoro di tesi si inserisce all’interno di uno studio più ampio, volto a caratterizzare la biodiversità della popolazione di enterobatteriacee nel microbiota fecale di 20 soggetti sani e di verificare la distribuzione della presenza di determinanti genici di patogenicità nei biotipi di Escherichia coli isolati. In particolare, 3 dei 20 campioni fecali sono stati interamente processati per l’isolamento e la caratterizzazione dei biotipi nell’ambito di questo progetto di tesi. La ricerca dei determinanti genici di patogenicità è stata invece condotta sull’intero set di 51 biotipi di E. coli isolati dai 20 soggetti. Per la stima della carica di enterobatteriacee ed E. coli sono stati utilizzati terreni selettivi e differenziali MacConkey Agar (MC) e Hicrome Coliform Agar (CA). Nei 20 campioni, la carica di enterobatteriacee (CFU/g di feci bagnate) variava tra 2,55x105 e 1,24x108, con un valore medio di 2,63x107± d.s. 3,59x107, mentre gli E. coli erano compresi tra 3,36x105 e 9,32x107, con un valor medio di 2,58x107± d.s. 2,45x107 (CFU/g di feci bagnate). Per ogni campione sono state isolate 48 colonie con fenotipo da enterobatteriacea dalle piastre di MC e 48 colonie con fenotipo da E. coli da terreno CA. Gli isolati sono stati sottoposti a tipizzazione tramite ERIC-PCR e RAPD-PCR. Le enterobatteriacee sono state caratterizzate da un punto di vista tassonomico tramite sequenziamento parziale del gene codificante la subunità 16S del rRNA. Sono state così allestite due collezioni di enterobatteriacee e di E. coli isolati da soggetti sani. Ogni campione fecale presenta da un minimo di uno ad un massimo di cinque biotipi di E.coli per campione (media = 2,15), e da nessuno a otto biotipi di enterobatteriacee (media = 1,85) appartenenti alle specie Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter hormaechei, Enterobacter cloacae, Enterobacter ludwigii, Hafnia alvei, Serratia liquefaciens, Cronobacter sakazakii, Citrobacter freundii, Citrobacter amalonaticus, Morganella morganii, Raoultella ornithinolytica. I 51 ceppi E. coli isolati dai 20 donatori sono stati attribuiti ai filogruppi sulla base della classificazione di Clermont: il raggruppamento più numeroso include 14 ceppi (B2), 9 il gruppo B1 ceppi, 7 l’F, 6 il D e l’A, 3 il C e 2 l’E. Solo 4 ceppi non sono stati ricondotti ad alcun filogruppo. E’ emerso che i soggetti sani ospitano una popolazione di E. coli riconducibili a filogruppi potenzialmente patogeni (B2, D, E, F), oltre che a filogruppi commensali considerati innocui (A, B1, C). Mediante reazioni di PCR multiplex, è stata verificata la presenza di 34 determinanti genici di patogenicità nei 51 ceppi di E. coli (adesine, tossine, siderofori, pili…). In media sono presenti 8,75 geni di virulenza per ceppo (0 - 20 per ceppo). Gli E. coli appartenenti ai filogruppi F e B2, riconducibili a ceppi potenzialmente patogeni, presentano il 42% e 40% di positività sul totale dei geni saggiati. I ceppi del filogruppo E presentano una percentuale relativamente bassa di geni di virulenza (19%), nonostante questo sia considerato un filogruppo contenente batteri potenzialmente patogeni. Questi risultati indicano che la popolazione di coliformi è caratterizzata da una forte presenza di ceppi potenzialmente patogeni, rappresentando un reservoir di possibili agenti eziologici di malattie all’apparato urinario, dell’intestino ed extraintestinali.
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