Riassunto analitico
Gli acidi biliari, quali ad esempio l’acido ursodesossicolico (1), sono composti ampiamente utilizzati in ambito farmacologico, in particolare per il trattamento della calcolosi biliare. Da qui è nato l’interesse, presso il laboratorio ICRM-CNR dove è stato svolto il lavoro sperimentale di questa tesi, di avviare diversi progetti mirati allo sviluppo di un approccio biocatalitico per la modifica selettiva di queste molecole. In particolare, nell’Istituto esiste una consolidata linea di ricerca sulle cosiddette idrossisteroide deidrogenasi (HSDH), ossidoriduttasi NAD(P)H-dipendenti ad elevata selettività (regio- e stereo) per gruppi ossidrilici e chetonici in posizioni definite dello scheletro steroidico.Il presente lavoro di tesi aveva come scopo la scoperta e la caratterizzazione di nuove HSDH microbiche di possibile interesse industriale. Per il raggiungimento di questo obiettivo sono stati utilizzati diversi approcci. In particolare, le HSDH da Staniera cyanosphera, da Halomonas halophiluse da Lysinibacillus sphaericus sono state identificate per omologia di sequenza con altre HSDH note facendo allineamenti multipli nel database BLAST, mentre la HSDH ngi1 è stata trovata mediante ricerca per omologia di sequenze in un database di sequenze metagenomiche.
I geni selezionati, codificanti per le diverse HSDH putative, sono stati clonati in opportuni vettori di espressione in frame con una coda di sei residui di istidina. Una volta clonati i geni, gli enzimi sono stati over-espressi in Escherichia coli sfruttando la sequenza del promotore dell’operone Lac regolata dall’induttore di espressione isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG). I biocatalizzatori così prodotti sono stati purificati mediante colonna cromatografica di affinità su resina Ni-NTA. Gli enzimi sono stati ottenuti in forma pura con buone rese.
Dopo aver verificato che effettivamente i diversi biocatalizzatori prodotti fossero attivi sugli acidi biliari di interesse, è stata determinata (o confermata) la loro stereo selettività. Si è potuto stabilire che l’enzima da Staniera cyanosphera è una 7β-HSDH, da Lysinibacillus sphaericus è una 12α-HSDH, la ngi1 è una 7α-HSDH e infine, che l’enzima da Halomonas halophiluse agisce sugli ossidrili in posizione C-7, ma non è stereoselettivo.
Le quattro nuove HSDH sono state poi caratterizzate dal punto di vista biochimico. È stata quindi valutata la loro attività a diversi valori di pH e di temperatura, e sono stati determinati i parametri cinetici (KM e Vmax) in presenza di diversi acidi biliari accettati come substrati.
Infine, sono state allestite prove di reazioni redox selettive su acidi biliari, utilizzando le HSDH sopra descritte accoppiate agli opportuni enzimi in grado di catalizzare in situ la rigenerazione del cofattore NAD(P(H).
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