Riassunto analitico
Il muscolo scheletrico è un tessuto che si estende per gran parte del corpo degli eucarioti superiori, rappresentando circa il 40% del loro peso. Una delle proprietà fondamentali del tessuto muscolare è la sua capacità di rigenerarsi in seguito a ripetute lesioni, in particolar modo grazie all’attivazione delle cellule staminali residenti nel muscolo, le cellule satelliti. In seguito a danno, le cellule satelliti attivate abbandonano lo stato di quiescenza, iniziano a proliferare e a differenziare, per ripristinare la normale omeostasi del muscolo. Durante lo sviluppo muscolare, la formazione delle miofibre è finemente regolata dalle proteine miogeniche regolatorie, tra cui MyoD, Miogenina, MRF4, MEF2s, e i geni strutturali muscolo-specifici come le actine, le miosine e le troponine. NF-Y è un importante fattore di trascrizione composto da tre subunità NF-YA, NF-YB e NF-YC che lega in modo specifico le CCAAT box presenti nei promotori e negli enhancer di molti geni eucariotici. NF-Y partecipa nella regolazione sia di geni ubiquitari che tessuto-specifici e ha un importante ruolo nel controllo della proliferazione cellulare e nel differenziamento. La subunità NF-YA è espressa in due forme alternative, NF-YAl ed NF-YAs, che differiscono per la presenza o meno dell’esone 3 nel dominio N-terminale. NF-YA è presente nei miociti ma è down-regolato durante il processo di differenziamento terminale. Non è ben chiaro se le due varianti di splicing abbiano una differente funzione nella proliferazione e nel differenziamento del muscolo, pertanto lo scopo del lavoro è stato studiare nel dettaglio come le due forme partecipano alla proliferazione e al differenziamento, sia in cellule muscolari murine immortalizzate (C2C12) che in mioblasti primari. Per prima cosa abbiamo dimostrato che entrambe le forme di NF-YA sono espresse nelle cellule C2C12 proliferanti, anche se NF-YAl è la predominante. Inoltre abbiamo visto che, durante il differenziamento, sia NF-YAs che NF-YAl diminuiscono a livello trascrizionale. Attraverso esperimenti di RNAi, abbiamo dimostrato che NF-YA è importante sia nella proliferazione che nel differenziamento delle C2C12. Per valutare meglio il ruolo di NF-YAs/l, abbiamo creato linee cellulari murine che esprimono stabilmente o la forma corta o la forma lunga della subunità e abbiamo studiato gli effetti durante il programma differenziativo. I nostri dati sottolineano che NF-YAl induce le cellule al differenziamento grazie all’attivazione dei marker miogenici e la formazione di miofibre multinucleate di grosso calibro, mentre NF-YAs porta alla diminuzione delle proteine miogeniche senza la formazione di miofibre. Infine, mediante esperimenti di immunofluorescenza, RT-PCRs e western blot, abbiamo studiato NF-YA durante il processo di rigenerazione muscolare. Le analisi svolte indicano che sia NF-YAs che NF-YAl sono attivati a livello trascrizionale nel muscolo in rigenerazione, suggerendo un loro coinvolgimento nella risposta rigenerativa del muscolo scheletrico.
|
Abstract
Skeletal muscle is the largest tissue found in the animal body, accounting for about 40% of adult body weight. A remarkable property of muscle tissue is the capacity to regenerate after repeated injuries, especially through the activation of resident stem cells, namely Satellite Cells (SCs). Upon damage, activated SCs escape from quiescence, start to proliferate and differentiate to restore muscle homeostasis.
Myofibers formation, during muscle development is orchestrated by Myogenic Regulatory Factors (MRFs), including myogenic differentiation factor (MyoD), Myogenin, MRF4, MEF2s, and muscle-specific structural and contractile genes, such as actins, myosins, and troponins. NF-Y is a pioneer transcription factor (TF) complex, composed of three subunits NF-YA, NF-YB and NF-YC, that binds the CCAAT box, a common cis-acting regulatory element found in promoters and enhancers of a large number of genes in higher eukaryotes. NF-Y is involved in the regulation of many tissue-specific and housekeeping genes and has a key role in the control of cell proliferation and differentiation. The NF-YA subunit is expressed in two alternatively spliced isoforms, NF-YAs and NF-YAl which differ for the presence of Exon 3 in the N-terminal domain. NF-YA is present in myocytes but is subsequently down-regulated during differentiation to myotubes to allow terminal differentiation. It has not been yet elucidated if NF-YA splice variants have different function in muscle proliferation and differentiation. The aim of my work was therefore to study the biology of NF-YA splice variants in the proliferation and differentiation of immortalized (C2C12 cells) and primary myoblasts (SCs) through loss and gain of function approaches. First, we show for the first time that both the NF-YA splice variants are expressed in proliferating C2C12 cells, although NF-YAl is the major isoform. Moreover, both the NF-YA isoforms decrease at the transcriptional level during differentiation. Then, through RNAi experiments, we demonstrate that NF-YA is important for both proliferation and differentiation of C2C12 cells. To assess the role of NF-YA variants, we created stably infected C2C12 cells overexpressing NF-YAs and NF-YAl. We studied the effects of NF-YAs/l on the differentiation program: our data highlight that NF-YAl is able to enhance cell differentiation through the activation of myogenic markers and the formation of big and multinucleated myofibers, in opposition to NF-YAs, which decreases the expression of myogenic proteins and impairs myofibers formation.
Finally, we investigate the biology on NF-YA in the muscle regeneration process. The analysis of cardiotoxin-injuried mouse muscles through immunofluorescence, RT-PCRs and western blot indicate that both the NF-YA slice variants are transcriptionally induced in regenerating muscles.
Taken together these data suggest that both NF-YA short and long isoforms can take part in skeletal muscle regenerative response.
|
