• EpidermolysisBullosa
• Genome-editing
• Homology
• knock-in
• TALENs

Una delle più grandi sfide dell’ingegneria genetica negli ultimi anni è lo sviluppo di tecnologie in grado di modificare il genoma umano in maniera sito-specifica. Lo sviluppo di nucleasi ingegnerizzate ha permesso di aumentare la frequenza delle rotture a doppio filamento (DSB) in un locus prestabilito le quali possono essere naturalmente riparate attraverso meccanismi di Ricombinazione Omologa (HR) o non omologa (NHEJ). In particolare, la ricombinazione omologa consente la conversione genica tra un Donor stampo fiancheggiato da regioni omologhe al sito di taglio ed il locus genomico desiderato. Per questa ragione, Zinc-Finger Nucleasi (ZFNs), Transcription Activator-like Effector Nuclease (TALENs) e Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated (CRISPR/Cas9) hanno dato via ad una serie di nuove strategie, come gene addition, gene replacement or gene knock-down, capaci di editare in maniera diretta una specifica sequenza di DNA.
In questa tesi è mostrata l’applicazione di una particolare strategia di Genome Editing per il trattamento dell’Epidermolisi Bollosa Giunzionale ereditaria (JEB), un raro disordine caratterizzato da fragilità meccanica e funzionale della pelle e delle mucose a causa di differenti mutazioni soprattutto correlate ad uno dei geni che partecipa alla codifica della laminina-332: LAMB3. Per contrastare questa malattia contraddistinta soprattutto per la sua enorme eterogeneità nel tipo e nel numero di mutazioni lungo tutto il gene, una strategia di knock-in è stata sviluppata. Il progetto punta nella quasi completa sostituzione del gene mutato con uno splicable e promotorless Donor codificante per il cDNA di LAMB3 dall’esone 3 fino alla fine del gene (esone 23) in grado di ripristinare l’espressione di laminina-B3 sotto il suo promotore endogeno. Per raggiungere questo obiettivo, sono state disegnate TALENs sito specifiche per il taglio lungo l’introne 2 deliverate sotto forma di mRNA o DNA plasmidico, al fine di indurre HR in situ del Donor trasdotto mediante vettore lentivirale non integrante (IDLV). Al fine di indurre la correzione del gene, JEB immortalizzate (iJEB) caratterizzate da una mutazione omozigote c.1945dupG che causa la formazione di un codone di stop prematuro (PTC) sull’esone 15, sono state usate come modello cellulare in vitro. Una volta deliverati entrambi i costrutti, Off-target e citotossicità sono state esaminate. La popolazione delle iJEB trattate è stata successivamente sortata e clonata grazie all’espressione della cassetta GFP inserita all’interno del Donor a valle del cDNA LAMB3. I cloni immortalizzatati sono stati poi screenati per PCR sulla giunzione genomica al 5’ (5’TI) ed attraverso qRT-PCR e Western Blot per l’espressione della laminina-332. Per dimostrare che le cellule corrette per LAMB3 sostengono l’espressione in vivo, una popolazione di iJEB trattate è stata iniettata a livello sottocutaneo in cinque topi immunodeficienti. Analisi Molecolari condotte su biopsie confermano la corretta ricombinazione omologa del Donor e il ripristino della produzione di laminina-332. Una volta dimostrato che questo knock-in può essere applicato per la correzione di difetti lungo LAMB3, è stata considerata l’efficienza della strategia. Come già riportato, l’efficienza di HR in cellule primarie è veramente piccola e non può essere traslata a livello preclinico o in clinica a meno che le cellule corrette vengano selezionate per vantaggio di adesione. Come riportato in precedenza da Dellambra et al, il ripristino della laminina-332 conferisce alle cellule LAMB3-corrette un vantaggio di adesione in vitro, dimostrando così che le iJEB trattate possono essere arricchite in questo modo. In conclusione, i dati forniscono una prova di principio che la correzione in situ all’interno del locus nativo di LAMB3 possa aprire nuove possibilità per il trattamento delle malattie genetiche della pelle.

One of the greatest challenges in genome engineering is the development of technologies able to modify human genome in a site-specific manner. A promising general strategy for editing the genome in living cells raised few years ago with the development of engineered nucleases able to boost the frequency of double strand breaks (DSBs) into a targeted locus that could be naturally repaired by homologous recombination (HR) or non-homologous end joining (NHEJ) leading to gene addition, gene replacement or gene knock-down. In particular, HR enables gene conversion between a therapeutic donor flanked by sequences homologous to the damaged site and the target genomic locus. For this reason, Zinc-Finger Nuclease (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nuclease (TALENs) and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated (CRISPR/Cas9) opened new applications for specific genome engineering. Since their initial effective application as proof of concept in basic science, genome editing paved the way for its application in preclinical and clinical gene therapy approaches for many diseases. In this thesis is showed the application of genome editing technology to the treatment of inherited Junctional Epidermolysis Bullosa (JEB), a rare genetic skin disorder characterized by structural and mechanical fragility of skin and mucosal membranes due to mutations mainly into LAMB3 gene. To tackle this disease that exhibit heterogeneity in the location and number of mutated sequences, a knock-in gene strategy was developed. The project aims to the almost complete substitution of LAMB3 transcription unit carrying the mutations causing-disease with a promoterless splicible wt LAMB3 cDNA spanning from exon 3 to the end of the gene (exon 23) able to restore the laminin-B3 expression under its endogenous promoter. To achieve this goal, site-specific TALENs, delivered by non-viral methods (mRNA or plasmid DNA), were tailored to the intron 2 of LAMB3 gene in order to induce locus-specific HR of the corrected therapeutic donor packaged into non-integrating lentiviral vector (IDLV). To address the correction of LAMB3 gene, immortalized JEB (iJEB) cells, bearing homozygous c.1945dupG mutation into LAMB3 gene causing a premature stop codon (PTC), were used as in vitro model. After transfection/transduction of the TALENs and donor template, safety and cytotoxic issues were evaluated. The bulk population of treated iJEB was FACS-sorted and cloned thanks to the expression of the GFP inserted in the donor template downstream the LAMB3 cDNA. Immortalized JEB clones were then screened by PCR on 5’ donor-genome junction (5’TI) and by qRT-PCR and Western Blot for the expression of laminin-332. To further determine whether LAMB3-corrected cells sustain laminin-332 expression in vivo, treated iJEB bulk was subcutaneously injected into five immunodeficient mice. Molecular analysis on small skin biopsy confirmed the correct HR on the donor vector and the restoration of laminin-332 production. Once demonstrated that the knock-in strategy could be applied to the correction of LAMB3 defects, the efficiency issue was considered. As already reported, the efficiency of HR in primary cells is really poor and could not be translated to any preclinical application unless selective advantage of the corrected cells could be exploited. As previously reported, laminin-332 restoration confers an in vitro adhesion advantage of LAMB3-corrected cells (Dellambra et al. 1998), thus demonstrating that treated iJEB bulk could be enriched by selective adhesion of the corrected cells. In conclusion, the data provide proof-of principle that TALENs-mediated in situ correction into LAMB3 native locus opens new possibilities for the treatment of genetic skin diseases.