Riassunto analitico
Il carcinoma ovarico (OC) è il settimo tumore più comune nelle donne e l'ottava causa di morte per cancro tra le donne in tutto il mondo. La diagnosi tardiva, a causa dell’aggressività e dei sintomi silenti, associata alla resistenza dei trattamenti di prima linea, pone la necessità di identificare nuove armi farmacologiche per affrontare questa malattia. È noto che la modulazione del proteoma sierico può essere associata ad un'alterazione dello stato di salute, oltre che alla risposta alla terapia, e questo spiega l'importanza di identificare specifici biomarcatori in questo liquido biologico. Negli ultimi quindici anni l'analisi proteomica combinata con la spettrometria di massa (MS) è diventata un importante strumento per la scoperta di nuovi biomarcatori utili nell'approccio clinico.
Il mio lavoro di proteomica si concentra su due aspetti:
1. Parte dell'esperimento di un precedente studio “Profilo proteico predittivo della risposta al trattamento con FOLFOX-4 in pazienti affette da OC mediante MS e analisi bioinformatica” eseguito su spettrometro di massa nLC-ESI-QTOF presso UniMiBi. Alcuni esperimenti sono stati condotti su due campioni selezionati presso il DSV UniMore, Prof. MP Costi) e CIGS, utilizzando un approccio semi-targeted sul set delle 12 proteine identificato con una diversa strategia presso l'Università Bicocca di Milano. Gli esperimenti Unimore sono stati eseguiti senza l’utilizzo di una sorgente nano-LC (sezione a);
2. Un approccio proteomico, in un'analisi di MS differenziale, è stato utilizzato per studiare le modulazioni delle proteine sieriche basali di 32 pazienti affette da OC sotto diverse terapie farmacologiche, con l'obiettivo di identificare un insieme di proteine associate alla risposta al trattamento. Lo studio proteomico fa parte della "discovery proteomics" in cui l'uso di un approccio label-free esplora l'intero proteoma sierico. Quest'ultimo approccio è applicato al progetto "Mito16a" uno studio multicentrico su pazienti con carcinoma ovarico epiteliale di fase III-IV, trattate con Carboplatino/Paclitaxel in combinazione con Bevacizumab (Avastin®), un anticorpo monoclonale, con target il fattore di crescita endoteliale vascolare VEGF-A (sezione b).
Conclusioni
Parte I. L'approccio adottato nell'elaborazione dei campioni nello studio di Modena ha rivelato risultati coerenti con quelli riscontrati nell'esperimento della Proteomica totale di Monza. Una valutazione sperimentale semi-targeted ha permesso di superare l'assenza di una sorgente ionica nano-ESI, quindi la possibilità di utilizzare una colonna capillare. È ampiamente noto che ciò avrebbe un impatto sulla durata della corsa e sulla separazione dei peptidi, ed è stato superato selezionando un set di peptidi proteotipici (Peptide Atlas) per ogni proteina colpita monitorata da quantificare, invece di concentrarsi sull'intera proteina. Confrontando i risultati, abbiamo concluso che il metodo progettato semi-targeted è utile per eseguire la quantificazione assoluta delle proteine senza la necessità di uno strumento dedicato e semplicemente interrogando un database di proteomica come alternativa all'uso dei peptidi triptici sintetizzati.
Parte II. Un approccio proteomico label-free ci ha permesso di determinare il risultato della modulazione delle proteine sieriche dello studio clinico MITO-16. L'interpretazione globale dei dati MS è stata assistita dall'analisi dei metadati ed è stata eseguita attraverso un'analisi differenziale tra i pazienti responder vs non responder al Bevacizumab. Le proteine differenzialmente espresse (DEPs) in modo significativo con FC>1.5 sono state sottoposte ad arricchimento di rete per chiarire il loro ruolo biochimico come biomarker predittivi della terapia. Infatti, alcune proteine delle DEP identificate sono proteine legate all'angiogenesi, quindi con il meccanismo d'azione del Bevacizumab.
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Abstract
Ovarian cancer (OC) is the 7th most common cancer in women and the eighth leading cause of cancer death among women worldwide. The late diagnosis, due to aggression and silent symptoms, in association with the resistance of the first line treatments, pose the need to identify new pharmacological weapons to deal with this disease.
It is widely known that the modulation of the blood proteome can be associated with an alteration in the state of health, as well as with the response to therapy and this explains the importance of identifying specific biomarkers in this biological liquid. Over the last fifteen years, Mass Spectrometry Proteomic analysis combined with Bioinformatics has become an important tool for the discovery of new biomarkers useful for clinical application.
My Proteomics work focuses on two main aspects:
I. A part of the experiment of a precedent study “Protein profile predictive of the response to FOLFOX-4 treatment in ovarian serous carcinoma patients through mass spectrometry and bioinformatic analysis” performed on nLC-ESI-QTOF Mass Spectrometer (Bruker) at University of Milan Bicocca. Some experiments were conducted on two properly selected samples in the Department of Life Sciences (Unimore,Prof. Maria Paola Costi) and CIGS, using a semi-targeted approach on the 12 proteins panel identified with a different strategy, whole proteomic MS study in Milan Bicocca University. The Unimore experiments were performed without the occurrence of a nano-LC supply (section a);
II. A whole proteomic approach, in a differential Mass Spectrometry analysis, was used to study the serum proteins modulations of 32 ovarian cancer patients under different drug therapies, with the aim of identifying a set of proteins associated with treatment response in patients. The proteomic study is part of "discovery proteomics" in which the use of a label-free approach explores the entire serum proteome. The latter approach is applied to the translational ovarian cancer project "Mito16", a multicenter study of patients with phase III-IV epithelial ovarian cancer, treated with standard first line chemotherapy, Carboplatin / Paclitaxel, in combination with Bevacizumab (Avastin®), an anti-angiogenic monoclonal antibody, which targets the pro-angiogenetic factor VEGF (section b).
Part I conclusion. The approach adopted in processing samples in Modena study revealed results consistent with the ones found in Monza total Proteomic experiment. A semi-targeted experiment assessment allowed to overcome the absence of a nano-ESI ion source, thus the possibility of using a capillary column. It is widely known that this would impact on run length and peptide separation, and has been logically overcome by pick-peaking a set of proteotypic peptides (Peptide Atlas) for each monitored hit protein to be quantified, instead of focusing on the entire protein coverage.
By comparing the results, we concluded that the semi-targeted designed method is useful to perform protein absolute quantification without the need for a dedicated instrument, and- on the other hand- by querying a proteome database as an alternative to the use of synthesized tryptic peptides.
Part II. A total, label-free Proteomics approach allowed us to determine the outcome of MITO-16 clinical trial serum proteins modulation.
The global interpretation of the data MS was assisted by metadata analysis and was performed through a differential analysis between Bevacizumab responding and non-responding patients will be run to statistically isolate proteins with highest/lowest fold-change (FC) and larger associated scores. The significantly differentially expressed proteins DEPs (FC > 1.5) undergo network enrichment to clarify their biochemical role as predictive biomarker to Bevacizumab therapy. In fact, some protein of DEPs identified are proteins related to angiogenesis, so with the Bevacizumab mechanism of action.
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