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I batteri acetici (BA) sono batteri aerobi obbligati appartenenti alla famiglia Acetobacteraceae. Sono conosciuti per la loro abilità di ossidare parzialmente i carboidrati e di rilasciare i corrispondenti metaboliti (acidi organici, aldeidi e chetoni) nel mezzo. Da molto tempo sono utilizzati per condurre reazioni di ossidazione dette “fermentazioni ossidative”, in particolare per la produzione di aceto. Negli ultimi anni i BA sono stati ampiamente studiati per il loro ruolo nell’industria alimentare e biotecnologica al fine di sfruttarne il potenziale metabolico per la sintesi di composti come acido gluconico, acido ascorbico, diidrossiacetone e cellulosa.

In questo studio è stata analizzata l’abilità dei BA di produrre acido gluconico, un acido debole, non volatile, inodore, non corrosivo, non tossico, biodegradabile e solubile in acqua. L’acido gluconico e i suoi derivati sono usati principalmente come additivi alimentari per regolare l’acidità, nell’industria farmaceutica come agenti chelanti di metalli bivalenti, per l’igiene in quanto hanno un’azione sequestrante in mezzo alcalino e in industrie di costruzione per prevenire le variazioni di colore. Questo acido organico è ottenuto tramite metodi biologici che coinvolgono la parziale ossidazione del glucosio. Per tale ragione l’acido gluconico è un esempio di come poter sfruttare i prodotti di scarto con alto contenuto di zuccheri. Sulla base di tali considerazioni, il presente lavoro di tesi affronta il consumo preferenziale delle fonti di carbonio da parte dei BA e la sintesi di acido gluconico. Il lavoro di ricerca comprende due parti: 1) l’individuazione di BA alto produttori di acido gluconico e 2) la definizione prioritaria di utilizzo delle fonti carbonio. La prima parte dell’attività include la selezione iniziale dei BA, in modo particolare l’abilità di sviluppo dopo rivitalizzazione in mezzo di coltura e la produzione di cellulosa da glucosio. Sono state presi in considerazione ceppi delle specie Acetobacter, Komagataeibacter e Gluconobacter, di cui G. oxydans è conosciuto per la sua forte abilità ossidativa nei confronti del glucosio. Conseguentemente, i ceppi sono stati testati per la capacità di sviluppo in mosto cotto d’uva e di produrre acido gluconico in condizioni statiche. Inoltre, sono stati condotti studi di produzione di acido gluconico in condizioni pilota. La seconda parte del lavoro di tesi tratta l’ossidazione delle fonti di carbonio: acido acetico, etanolo e glucosio. A tal fine sono stati formulati sette diversi terreni di coltura per individuare l’ordine preferenziale di consumo di acido acetico, etanolo e glucosio da parte dei BA. Dopo coltivazione, si è proceduto alla determinazione di acidità titolabile e pH come parametri preliminari per la scelta dei ceppi da analizzare mediante HPLC (High Pressure Liquid Chromatography). Sono stati analizzati i comportamenti di 6 ceppi di cui tre appartenenti al genere Gluconobacter (ATCC 621H, DSM 2003, DSM 3503T), due ad Acetobacter (AB0220, DSM 3509T) e un ceppo al genere Komagataeibacter (DSM 5602T). Dai risultati si evince che Acetobacter e Komagataeibacter ossidano l’etanolo e solo successivamente il glucosio; al contrario le specie Gluconobacter usano preferenzialmente il glucosio, per poi impiegare l’etanolo in un secondo momento. Infine, sono state ottenute ulteriori informazioni relative all’inibizione da parte dell’acido acetico.

In conclusione, lo studio di tesi compara ceppi di BA appartenenti a diverse specie. G. oxydans DSM 621H è stato il miglior produttore di acido gluconico in tutti i test effettuati, raggiungendo una produzione di circa 40 g/L. Inoltre i risultati ottenuti hanno permesso di determinare un ordine preferenziale delle fonti di carbonio, diverso in funzione delle specie.

Acetic acid bacteria (AAB) are obligatory aerobic bacteria within the family Acetobacteraceae. They are known for their ability to partially oxidize a variety of carbohydrates and to release the corresponding metabolites (organic acids, aldehydes and ketones) into the media. Since a long time they are used to perform specific oxidation reactions through processes called ‘‘oxidative fermentations’’, especially in vinegar production. In the last decades AAB have been widely studied because of their role in food and biotechnological industry, where their oxidation machinery is exploited to produce a number of compounds such as gluconic acid, L-ascorbic acid, dihydroxyacetone and cellulose. In this study AAB were investigated for their ability to produce gluconic acid. This acid is a weak, non-volatile, odorless, non-corrosive, non-toxic, easily biodegradable acid that is soluble in water. Gluconic acid and its derivatives are used mainly as additives in foods as acidity regulator, in pharmaceutical industry as chelating agent of divalent metals, in hygiene because of their sequestering action in alkaline media and in building industries to prevent color variations. This organic acid is usually obtained through biological methods involving the partial oxidation of glucose. For this reason, gluconic acid is an example of how some production wastes and surpluses with high carbohydrate contents can be optimally exploited. On the basis of these observations, the research work of this thesis focused the preferential carbon sources consumption by AAB and the synthesis of gluconic acid. The research activity is composed by two parts: 1) identification of high gluconic acid AAB producers and 2) explanation of carbon sources order use by these bacteria. The first part of the activity included an initial selection of AAB strains that were screened for their ability to fast grow after revitalization in culture media and for cellulose production from glucose. In particular we investigated gluconic acid as main product of glucose oxidation within species of the genera Acetobacter, Komagataeibacter and Gluconobacter. Among Gluconobacter genus, strains of G. oxydans species are well known for their ability to oxidize glucose to gluconate. Consequently, their capacity to grow on grape cooked must and to produce gluconic acid during a cultivation in static conditions was tested. In addition, we conducted tests on the gluconic acid production in pilot conditions. The second part of the thesis activity was focused on the carbon sources oxidation: acetic acid, ethanol and glucose. For that reason, we combined these substrates to define seven different media that allowed us to explain the preferential consumption of carbon sources. After a preliminary observation of titratable acidity and pH, we analyzed inoculated media through HPLC (High Pressure Liquid Chromatography): three strain of Gluconobacter (ATCC 621H, DSM 2003, DSM 3503T), two strains of Acetobacter (AB0220, DSM 3509T) and a strain of Komagataeibacter (DSM 5602T). These results elucidated that Acetobacter and Komagataeibacter oxidized ethanol as a preferential carbon sources and at a later time glucose; in contrast, Gluconobacter used glucose as a preferential carbon sources and then ethanol. Moreover, others information about the inhibitory actions of acetic acid, evolution of acidity and pH and gradual changes of substrates and products were obtained. In conclusion, this study compared different strains of AAB belonging to different species. G. oxydans DSM 621H was the best producer of gluconic acid in all tests and it could produce 40 g/L. In addition these findings allowed us to determine a preferential order of carbon sources, differently in according to the species.