Riassunto analitico
La birra è una delle bevande alcoliche fermentate più consumate al mondo. Si ottiene partendo da malto d’orzo o di qualunque altro cereale, luppolo e acqua mediante fermentazione alcolica con lieviti del genere Saccharomyces, quali Saccharomyces pastorianus e Saccharomyces cerevisiae per, rispettivamente, le birre lager e ale. In birre artigianali “old-style”, come le birre acide di tipo belga, la fermentazione può essere mista e prevedere anche il coinvolgimento di lieviti non-convenzionali e di batteri lattici, entrambi contaminanti spontanei delle materie prime o dell’ambiente del birrificio. Tali microorganismi sono stati recentemente rivalutati come “driver” di innovazione e diversificazione dei profili sensoriali delle birre artigianali. Per questa tipologia di birre, la fermentazione può essere spontanea o semi-spontanea e avviene in barili di legno dove, grazie al coinvolgimento di un microbiota complesso, può portare a profili sensoriali aciduli e peculiari. Tuttavia, se non correttamente gestita, la fermentazione mista può determinare anche a difetti sensoriali. L’obiettivo del presente lavoro di tesi è stata la caratterizzazione tassonomica e tecnologica del core microbiota responsabile della fermentazione semi-spontanea di birra acida prodotta in un microbirrificio della provincia di Bologna, allo scopo di costituire una biobanca di nuove colture di lievito sia Saccharomyces che non-Saccharomyces, per il futuro impiego come colture starter nella produzione di birra acida.
Approcci di DNA barcoding, basati sull’analisi PCR-RFLP della regione ribosomiale 5.8S-ITS e sul sequenziamento deldominio variabile D1/D2 del gene 26S rRNA, hanno permesso di identificare Saccharomyces cerevisiae (70% degli isolati) come specie dominante, seguita da Pichia membranifaciens (16%), Saccharomyces bayanus (6%), Dekkera bruxellensis (4%) e D. anomala (4%). L’analisi MSP-PCR della regione minisatellitare (GTG)5 ha portato all’identificazione di più biotipi all’interno di ogni specie. Il sequenziamento del gene ribosomiale 16s rRNA ha permesso di identificare tutti gli isolati batterici Gram positivi e catalasi negativi come appartenenti alla specie Pediococcus damnosus.
I lieviti S. cerevisiae hanno mostrato efficienza di sporificazione fra 22.70 e 23.84% dopo 3 giorni di incubazione su terreno agar acetato, mentre l’efficienza di sporificazione per i due ceppi di S. bayanus testati si attestava all’1.22 e 2.48%. La vitalità delle spore di S. cerevisiae variava dal 56 all’81%. Tutte le colture monosporali dei ceppi di S. cerevisiae hanno mostrato un genotipo MATa/MATα, supportando stato omotallico dei ceppi parentali di partenza.
Almeno un isolato per biotipo è stato preliminarmente testato per la capacità di assimilare glucosio e maltosio dopo 48 h di incubazione a 25°C. Il ceppo 122 di P. membranifaciens ha mostrato capacità di assimilare maltosio, nonostante la specie sia descritta come incapace di assimilare questo zucchero. Le prove di microfermentazione sono state condotte su malto luppolato (12°P; 22°C) con 4 ceppi di S. cerevisiae (104, 117, 203 e 220), 2 ceppi di P. membranifaciens (122 e 102), 1 ceppo di S. bayanus (213), 1 ceppo di D. anomala (59) ed un ceppo di D. bruxellensis (60). Il monitoraggio della CO2 rilasciata ha permesso di identificare i ceppi S. cerevisiae 117, 203 e 104 come quelli dotati di migliore performance fermentativa, seguiti da S. bayanus 213 e P. membranifaciens 122. In conclusione, la presente tesi ha permesso di caratterizzare dal punto di vista tassonomico e tecnologico il core microbiota responsabile del processo fermentativo di una birra acida e di costituire una biobanca di ceppi per futuri utilizzi come blend di colture starter in birrificazioni artigianali.
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Abstract
Beer is one of the most consumed fermented alcoholic beverages worldwide. It is obtained from barley malt, or malt of any other cereal, hops and water through the alcoholic fermentation carried out by Saccharomyces yeasts, such as Saccharomyces pastorianus and Saccharomyces cerevisiae for lager and ale beers, respectively. In traditionally fermented beer styles, such as Belgian-type sour beers, fermentation can be mixed and involves unconventional yeasts and lactic acid bacteria too. Both these microorganisms are spontaneous beer contaminants arisen from either raw materials or brewery environment and, recently, they have been revised as "drivers" of innovation and diversification of the sensory profiles in sour beer. Craft brewing fermentation can be spontaneous or semi-spontaneous and occurs in wooden barrels where the implantation of a complex microbiota can lead to acidic and peculiar sensory profiles. However, if not correctly managed, this mixed fermentation can be also responsible of sensory defects.
The aim of this thesis was to taxonomically and technologically profiling the core microbiota responsible for the semi-spontaneous fermentation of sour beer during the production in commercial craft brewery located in the province of Bologna (North of Italy) in order to identify new Saccharomyces and non-Saccharomyces yeast cultures to exploit as starters in sour beer production.
DNA barcoding approaches, based on PCR-RFLP analysis of the 5.8S-ITS ribosomal region and sequencing of the variable domain D1/D2 of the 26 rRNA gene, identified Saccharomyces cerevisiae (70% of the isolates) as the dominant species, followed by Pichia membranifaciens (16%), Saccharomyces bayanus (6%), Dekkera bruxellensis (4%) and D. anomala (4%). MSP-PCR analysis of the minisatellite region (GTG)5 allowed the identification of multiple biotypes within each species. Furthermore, we identified all the Gram positive and catalase negative bacterial isolates as belonging to the Pediococcus damnosus by sequencing the 16S rRNA gene.
S. cerevisiae yeasts showed sporification efficiency ranging from 22.70 to 23.84% after 3 days of incubation on acetate agar medium, while the sporification efficiency values of two S. bayanus strains were 1.22 and 2.48%, respectively. The viability of S. cerevisiae spores ranged from 56 to 81%. All the S. cerevisiae monosporic clones showed a MATa/MATα genotype, supporting their homothallic state of the corresponding parental strain.
At least one strain representative of each biotype was preliminarily tested for the ability to assimilate glucose and maltose after 48h of incubation at 25°C. P. membranifaciens strain 122 was able to assimilate maltose, although the species is described as unable to assimilate this sugar. Microfermentation tests were carried out for 4 S. cerevisiae strains (namely, strains 104, 117, 203 and 220), 2 P. membranifaciens strains (122 and 102), 1 strain of S. bayanus (213), 1 strain of D. anomala (59) and one strain of D. bruxellensis (60) using hopped malt (12° P; 22° C). The monitoring of the CO2 release over time allowed the identification of S. cerevisiae 117, 203 and 104 as the strains with the best fermentation performance, followed by S. bayanus 213 and P. membranifaciens 122.
In conclusion, this work provided the taxonomic and technological characterization of the microbiota core responsible for the mixed fermentation of a sour craft beer. Furthermore, a biobank of strains was implemented for future exploitation as new blends of starter cultures in craft breweries.
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