Riassunto analitico
Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula permette lo studio del profilo trascrizionale di ogni cellula di un campione. L’analisi di questi dati può essere utilizzata per identificare popolazioni cellulari, caratterizzare le interazioni cellula-cellula e comprendere il ruolo dei vari tipi cellulari nei processi biologici di interesse. Questo approccio è particolarmente importante per lo studio della biologia dei tumori: infatti, il microambiente tumorale è un insieme complesso di cellule maligne, cellule normali, stroma e infiltrato immunitario. Inoltre, la massa tumorale può anche essere composta da differenti sottopopolazioni. Di conseguenza, lo studio dei campioni tumorali a singola cellula è di grande importanza per la comprensione dei processi che guidano la formazione del tumore, lo sviluppo e le sue interazioni con il microambiente. Per l’analisi abbiamo utilizzato un modello murino di adenocarcinoma polmonare, ingegnerizzato con knockout condizionale per i due regolatori trascrizionali YAP e TAZ. La crescita di molti tumori solidi umani, tra cui quello polmonare, è legata all’ azione di questi due geni, la cui espressione è essenziale nei processi di proliferazione, metastasi e interazione delle cellule maligne con il microambiente.
In questo studio è stata eseguita l’analisi bioinformatica di dati di sequenziamento dell’RNA a singola cellula provenienti da biopsie murine di adenocarcinoma del polmone, confrontando cellule non trattate e campioni trattati per la rimozione dei geni YAP e TAZ a differenti punti temporali. Lo scopo della tesi è l’identificazione dei tipi cellulari presenti nel tessuto tumorale, la caratterizzazione delle cellule tumorali e del sistema immunitario e lo studio delle loro dinamiche e interazioni rispetto al tempo e al trattamento.
Per le analisi abbiamo utilizzato pacchetti R all’avanguardia (ad esempio Seurat, AUCell) per identificare i clusters, cioè le popolazioni cellulari, per assegnare loro un’etichetta e per determinare i geni differenzialmente espressi tra di essi. Abbiamo effettuato l’analisi di traiettoria applicando Monocle ai clusters di cellule tumorali e di cellule del sistema immunitario separatamente, allo scopo di verificare la presenza di un ordine di progressione delle cellule dato dai loro stati biologici. Infine, i clusters sono stati analizzati con CellPhoneDB per determinare le interazioni che essi instaurano sulla base dei ligandi e recettori che esprimono.
I risultati evidenziano una drastica riduzione del numero di cellule tumorali in seguito al knockout di YAP/TAZ e la presenza di differenti sottopopolazioni tumorali capaci di interagire con specifici tipi cellulari nel microambiente.
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Abstract
Single cell RNA sequencing allows studying the transcriptional profile of every cell composing a sample. The analysis of this data can be used to identify cell populations, characterize cell-cell interactions and understand the role of the various cell types in the biological processes of interest. This approach is particularly important for the study of tumor biology: indeed, the tumor microenvironment is a complex cell mixture comprising malignant and normal cells, stroma and immune infiltrate. Moreover, different subpopulations can also compose the tumor bulk. Therefore, studying tumor samples at the single cell level is of great importance for the understanding of the processes that guide tumor formation, development and its interaction with the microenvironment. Here we took advantage of a mouse model of lung adenocarcinoma, engineered with a conditional knockout for the two transcriptional regulators YAP and TAZ. The growth of many solid human tumors, including lung cancer, is linked to the action of these two genes, whose expression is essential in the processes of proliferation, metastasis and interaction of malignant cells with the microenvironment.
In this study, we performed a bioinformatics analysis of single cell RNA-seq data from mouse biopsies of lung adenocarcinoma, comparing untreated mice and samples depleted of YAP and TAZ at different time points. The purpose of the thesis is the identification of the cell types within the tumor tissue, the characterization of tumor and immune system cells, and the study of their dynamics and interplay upon time and treatment.
For the analyses we used state-of-the-art R packages (e.g. Seurat, AUCell) to identify clusters, i.e. cellular populations, to assign each cluster an annotation and to identify differentially expressed genes among the clusters. We carried out trajectory analyses applying Monocle to clusters of tumor and immune cells separately, to verify the existence of an order of progression of the cells given by their biological states. Finally, we analysed clusters with CellPhoneDB to determine their interactions on the basis of the expression of ligands and receptors.
The results highlight a dramatic reduction in the number of tumor cells after YAP/TAZ knockout and the presence of separate tumor subpopulations able to interact with specific cell types in the microenvironment.
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