• Bmi1
• Mucosa
• Orale
• Rigenerazione
• Staminale

I tessuti epiteliali ricoprono le cavità e le superfici di tutto il corpo. I cheratinociti dello strato basale giacciono sulla membrana basale e sono le sole cellule dell’epitelio stratificato dotate di capacità proliferativa. Le cellule staminali, le cellule “transient amplifying” (TA) e le TA precoci, isolate in coltura danno vita rispettivamente a olocloni, merocloni e paracloni. È stato dimostrato che il fattore di trascrizione p63 è abbondantemente espresso in olocloni di pelle e limbus corneale. Ad oggi p63 è uno dei pochi marcatori di cellule staminali identificati in pelle e limbus. A partire da queste considerazioni sono stati studiati altri epiteli di rivestimento.
L’epitelio analizzato in questo studio è la mucosa orale. Questo tessuto è largamente utilizzato in chirurgia come strumento per la medicina rigenerativa. Ad esempio, in oftalmologia è stato trapiantato come tessuto sostitutivo della cornea in casi di Deficit Bilaterale di Cellule Staminali Limbari (LSCD).
Il primo passo verso una rigenerazione in vitro della mucosa è una sua completa caratterizzazione, specialmente nel compartimento staminale e nelle cellule differenziate, al fine di avere appropriati saggi di controllo qualità e di rilascio.
I campioni di mucosa orale sono stati prelevati da numerosi donatori sani. Sono state allestite colture primarie, poi coltivate fino a differenziamento e senescenza. Sono stati ottenuti olocloni, merocloni e paracloni da analisi clonali di differenti donatori e, parte delle biopsie, sono state criopreservate per analisi in vivo.
Sono state studiate le citocheratine sia in vivo che in vitro per confrontarne l’espressione tra la mucosa in in vivo e quella coltivata in laboratorio. Inoltre, sono stati studiati possibili marcatori di cellule staminali. Il primo fattore analizzato, è il fattore di trascrizione p63, per ragioni già evidenziate in altri epiteli di rivestimento. Sono stati analizzati anche altri due marcatori correlati alle staminali limbari, Bmi1 e C/EBPdelta. Infine, sono state studiate altre proteine come Klf4 e Sox2, per la loro correlazione alla tumorigenesi della mucosa orale e di altri epiteli, e per la loro importanza nelle staminali embrionali. Il recettore p75 è stato analizzato per il ruolo descritto in letteratura di mantenimento della staminalità nella mucosa orale.
I pattern di espressione in vivo sono stati identificati attraverso immunofluorescenza in criosezioni confermando la presenza dei marcatori selezionati in cellule basali o soprabasali. Inoltre sono state svolte analisi in vitro come western blot di lifespan o di singoli tipi clonali. Alcuni fattori mostravano una riduzione della loro espressione durante la conversione clonale rivelando la loro importanza negli stadi indifferenziati della coltura.
Per il trapianto ex vivo della mucosa orale nella LSCD il problema rimane la univoca identificazione di mucosa da cornea e da congiuntiva per interpretare correttamente il follow-up dei pazienti. Attraverso microarray tra i vari mRNA estratti da olocloni di limbus, congiuntiva e mucosa orale abbiamo individuato tre marcatori candidati per la caratterizzazione della mucosa: Pax6, Pitx2 e Sox2. I trascritti e l’espressione proteica dei tre marcatori è stata studiata sia in vivo che in vitro nei tre tessuti.
Bmi1 è stato studiato approfonditamente considerando la sua espressione nella mucosa orale, in vivo ed in vitro, rispecchiando quella riscontrata nel limbus corneale dove è stato già associato a staminalità. Per queste ragioni abbiamo studiato la sua funzione ed i pathways associati, con esperimenti di silenziamento.
Questi studi sono mirati al disegno di saggi di controllo qualità o di rilascio per la ricostruzione in vitro della mucosa orale finalizzata a protocolli di terapia cellulare.

Epithelial tissues cover the cavities and surfaces of structures throughout the body. Keratinocytes forming the basal layer lie on the basement membrane and are the only cells in a stratified epithelium endowed with proliferative capacity. Keratinocyte stem cells, transient amplifying (TA) and "early"-TA cells when isolated in culture give rise to holoclones, paraclones and meroclones, respectively. p63 transcription factor was shown to be abundantly expressed by epidermal and limbal holoclones, but it is almost undetectable in paraclones. Nowadays, p63 is one of few stem cell markers identified in corneal limbus and skin. Starting from this findings other epithelia were investigated. The epithelium analyzed in this study, is the oral mucosa. This tissue is wide used in surgery as a regenerative medicine tool. In ophthalmology, for instance, it has been transplanted as corneal-like tissue in bilateral Limbal Stem Cell Deficiency (LSCD). An extensive characterization of the oral mucosa in particular, the stem compartment and differentiated cells, represents the first step towards in vitro tissue regeneration, quality control and end-points assays. Specimens of oral mucosa have been taken from several healthy donors. Biopsies were processed to obtain primary cultures, cultured up to differentiation and replicative senescence. In addition, clonal analysis have been performed from primary cultures, to obtain holoclones, meroclones and paraclones from multiple processed oral mucosae. Part of the biopsies have been cryopreserved for in vivo studies. Cytokeratins of basal and differentiated layers were studied both in vivo and in vitro to compare their expression in cultures. Different potential stem cell markers for oral mucosa have been investigated. First of all, the p63 transcription factor was investigated, due to its role in epithelial cells, as previously shown. Moreover, two additional transcription factors related to stem cells of other epithelia, namely Bmi1 and C/EBPdelta, have been analyzed. Additional proteins, Klf4 and Sox2, have been studied for their relationship with tumorigenesis of oral mucosa and other epithelia and for their importance in embryonic stem cells. Finally, p75, a neurotrophin receptor, has been also investigated as potential stem cell marker for oral mucosa, as suggested in scientific literature. First of all, the in vivo patterns have been shown by immunofluorescence on cryosections confirming the basal or suprabasal expression. Furthermore, in vitro assays, such as western blot analysis on lifespan or on clonal types of oral mucosa, have been performed. Different factors decrease their expression over clonal conversion, highlighting their role in the early stages of the culture. The ex vivo expanded oral mucosa transplantation in LSCD, the main problem is the unambiguous identification of oral mucosa tissue from cornea and conjunctiva tissue, in order to evaluate the follow-up outcome on patients. Microarrays analysis on mRNAs extracted from holoclones of limbus, conjunctiva and oral mucosa allowed the identification of three candidate markers: Pax6, Pitx2 and Sox2. The mRNA and the protein expression of these markers have been studied both in vivo and in vitro in the tree tissues. Bmi1 protein has been thoroughly studied based on its in vivo and in vitro expression in oral mucosa and our studies suggested similar expression as in corneal limbus where it was associated to stem cell maintenance. On this basis, its function and related pathways were studied in loss-of-function experiments. These studies target to design characterization, quality control and end-points assays for in vitro oral mucosa reconstruction aimed to cell therapy protocols.