Riassunto analitico
La mielofibrosi primaria (PMF) appartiene alle neoplasie mieloproliferative Philadelphia-negative e presenta megacariociti iperplastici/displastici e mielofibrosi. Il rilascio deregolato di citochine e fattori di crescita da parte delle cellule emopoietiche maligne, in particolare monociti e megacariociti, è coinvolto nella distruzione della struttura del midollo osseo. E' importante quindi identificare nuove strategie terapeutiche in grado di ripristinare l'omeostasi del microambiente midollare nei pazienti di PMF.
Al fine di caratterizzare i meccanismi responsabili della patogenesi della PMF, abbiamo di recente analizzato il profilo di espressione genica (GEP) dei progenitori emopoietici CD34+ di pazienti di PMF e donatori sani (HD), e abbiamo evidenziato l'upregolazione del fattore di trascrizione MAF (v-maf avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog) nelle cellule CD34+ di PMF.
Al fine di investigare il ruolo di MAF nella patogenesi della PMF e di riprodurre la condizione che abbiamo osservato nelle cellule CD34+ di PMF, abbiamo overespresso MAF in cellule CD34+. A tal fine, le cellule CD34+ purificate da sangue cordonale sono state trasdotte con i vettori retrovirali esprimenti le sequenze codificanti per le due varianti del trascritto di MAF (LMAFVAR1IDN e LMAFVAR2IDN) o con il vettore vuoto LXIDN, che è stato usato come controllo.
Per prima cosa abbiamo analizzato gli effetti dell'overespressione di MAF sul differenziamento delle cellule CD34+ e abbiamo dimostrato che l'overespressone di MAF favorisce il commitment megacariocitario e quello mono/macrofagico.
In seguito abbiamo analizzato il GEP delle cellule CD34+ overesprimenti MAF e abbiamo confermato l'upregolazione di geni coinvolti nella megacariocitopoiesi e nel differenziamento mono/macrofagico. L'analisi del GEP ha inoltre evidenziato l'upregolazione di geni associati a processi deregolati nella PMF, quali fibrosi, angiogenesi ed infiammazione; un numero elevato di trascritti associati a infiammazione e fibrosi codificano per proteine secrete.
Sulla base del loro putativo ruolo in infiammazione e fibrosi, abbiamo selezionato alcuni di questi geni codificanti per molecole secrete e le abbiamo quantificate mediante saggi immunoenzimatici nei surnatanti cellulari derivanti dalle cellule che overesprimono MAF e nel plasma di pazienti di PMF e HD.
I nostri dati mostrano che l'upregolazione di MAF è responsabile dell'aumento nel plasma dei pazienti con PMF di diversi mediatori proinfiammatori e profibrotici (IL8, CCL2, PLAUR e MMP9). In particolare, l'overespressione di MAF è responsabile dell'aumentata espressione dei mediatori profibrotici LGALS3 e SPP1 nei pazienti con PMF rispetto ai HD.
Dato che l'aumento della proliferazione dei fibroblasti è coinvolto nello sviluppo della fibrosi midollare ed è una delle caratteristiche tipiche della PMF, abbiamo investigato gli effetti di LGALS3 e SPP1 sui fibroblasti dimostrando che essi promuovono la proliferazione dei fibroblasti e l'espressione del collagene I.
Abbiamo poi analizzato le caratteristiche cliniche dei pazienti di PMF sulla base dei livelli plasmatici di SPP1 e LGALS3; abbiamo osservato che aumentati livelli plasmatici di SPP1 nei pazienti di PMF correla con un grado di fibrosi più severo.
Al fine di confermare il ruolo di LGALS3 e SPP1 come nuovi putativi marker di malattia, abbiamo testato LGALS3 e SPP1 in una coorte più ampia di campioni di plasma e abbiamo dimostrato che SPP1 è un marker di fibrosi midollare specifico della PMF.
In conclusione, i nostri dati dimostrano il coinvolgimento di MAF nelle alterazioni dello stroma midollare tipiche della PMF, in particolare nello sviluppo di fibrosi, attraverso l'induzione di un fenotipo profibrotico e proinfiammatorio nelle cellule mieloidi differenziate maligne.
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Abstract
Primary Myelofibrosis (PMF) is a Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasm characterized by hyperplastic/dysplastic megakaryocytes and myelofibrosis. The deregulated release of cytokines and growth factors by malignant hematopoietic cells, particularly monocytes and megakaryocytes, is involved in the disruption of the bone marrow (BM) structure. Therefore, it remains of primary importance to identify novel therapeutic strategies to restore BM microenvironment homeostasis in PMF patients.
In order to better characterize the molecular mechanisms underlying PMF pathogenesis, we recently analysed the gene expression profile (GEP) of CD34+ hematopoietic progenitor cells from PMF patients and healthy donors (HDs), and highlighted the upregulation of the transcription factor MAF (v-maf avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog) in PMF CD34+ cells.
With the aim to investigate the role of MAF in PMF pathogenesis and to reproduce the condition observed in PMF CD34+ cells, we overexpressed MAF in CD34+ cells. Human cord blood-derived CD34+ cells were transduced with a retroviral vector carrying the coding sequences for the two MAF transcript variants (LMAFVAR1IDN and LMAFVAR2IDN) or the empty vector LXIDN, used as control.
First, we analysed the effects of MAF overexpression on CD34+ cells differentiation and we demonstrated that the forced expression of MAF favours the megakaryocyte and monocyte/macrophage commitment.
Next, we analyzed GEP of MAF-overexpressing CD34+ cells and we confirmed the upregulation of genes involved in megakaryopoiesis and in monocyte/macrophage differentiation. GEP also revealed the upregulation of genes related to processes deregulated in PMF, such as fibrosis, angiogenesis and inflammation. Noteworthy, a considerable number of inflammation- and fibrosis-related transcripts encoded for secreted proteins involved in these processes.
Owing to their putative role in inflammation and BM fibrosis, we selected a subset of genes coding for secreted molecules and we assessed them on culture supernatants from LMAFVAR1IDN, LMAFVAR2IDN and LXIDN-transduced cells and plasma samples from PMF patients and HDs by quantitative enzyme-linked immunoassays.
Our data unveiled that the upregulation of MAF was responsible for the increased plasma levels of key proinflammatory and profibrotic mediators (IL8, CCL2, PLAUR and MMP9) in PMF patients. In particular, MAF overexpression was responsible for the increased expression of the profibrotic mediators LGALS3 and SPP1 in PMF patients compared to HDs.
Since the increased proliferation of fibroblasts is involved in BM fibrosis and is a PMF feature, we investigated the effects of LGALS3 and SPP1 on fibroblast and we demonstrated that they promote fibroblast proliferation and collagen I expression.
Then, we compared hematological, clinical and molecular characteristics of PMF patients according to the SPP1 and LGALS3 expression levels in the plasma. In particular, we observed that increased SPP1 plasma levels in PMF patients correlate with a more severe fibrosis and a lower overall survival.
Finally, in order to further confirm the relevance of LGALS3 and SPP1 as novel putative disease markers, we assessed LGALS3 and SPP1 in a larger cohort of plasma samples and demonstrated that SPP1 is a marker of bone marrow fibrosis specific of PMF.
In conclusion, our data unveiled the involvement of MAF in bone marrow stromal changes typical of PMF, particularly in fibrosis development, through the induction of a profibrotic and proinflammatory phenotype in the malignant myeloid differentiated progeny.
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