Riassunto analitico
L’Epidermolisi Bollosa (EB) comprende un gruppo di malattie genetiche della pelle che si manifesta con erosione della cute e delle mucose associata ad infezioni ricorrenti, nonché al rischio di sviluppo di carcinomi. Ad oggi non esistono cure definitive, l’unico approccio risolutivo è rappresentato dalla terapia genica che consiste nel trapianto autologo di epidermide rigenerata in vitro a partire da cellule staminali geneticamente corrette. Ad oggi, il follow-up di due distinte sperimentazioni di fase I/II, dimostra l’assenza di eventi avversi, il recupero funzionale e la scomparsa della malattia nelle zone trapiantate confermando la sicurezza ed efficacia dell’approccio. La correzione è stata eseguita utilizzando un vettore retrovirale derivato dal virus della Leucemia Murina di Moloney (MLV-RV) in cui il cDNA codificante per la catena β3 della laminina 5 è sotto il controllo del promotore virale LTR. Tuttavia, in sperimentazioni cliniche condotte con cellule staminali ematopoietiche, il vettore MLV è risultato essere associato a rischio di “genotossicità”. Questo ha reso necessaria la messa a punto di saggi di sicurezza ex vivo volti a valutare il rischio di mutagenesi inserzionale legato all’utilizzo del MLV-RV nei cheratinociti.
L’obiettivo di questa tesi è stato sviluppare saggi su cheratinociti umani primari che identificassero il rischio di genotossicità associato alla terapia genica in tre diverse forme di EB, utilizzando quindi tre vettori MLV-derivati specifici per laminina 5-β3, collagene 17, collagene 7. Il percorso sperimentale ha inizio con la verifica dell’elevata efficienza di correzione delle cellule isolate dai pazienti e della corretta espressione delle proteine esogene. In seguito, tali cellule sono state utilizzate per mettere a punto i seguenti saggi di genotossicità. Per escludere riarrangiamenti cromosomici, dovuti all’inserzione del transgene e connessi ad un potenziale rischio di aberrazione genica, è stato effettuata l’analisi del cariotipo dei cheratinociti corretti. Il saggio in soft agar ha valutato l’incapacità delle cellule corrette di formare colonie in vitro in un mezzo semisolido, escludendo la crescita in assenza di adesione e l’attivazione di processi che in vivo condurrebbero ad invasione e sviluppo di metastasi. Considerando che la proliferazione incontrollata in assenza di fattori paracrini è una caratteristica delle cellule immortalizzate, è stata verificata l’incapacità delle cellule corrette di crescere indipendentemente dalla somministrazione di ormoni al terreno di coltura e di feeder layer necessari per la crescita dei cheratinociti in vitro. Infine, la proliferazione in assenza d’inibizione da contatto, caratteristica delle cellule trasformate, è stata valutata tramite un saggio in cui l’intera progenie cellulare derivante dalla popolazione corretta è stata sottoposta a cultura seriale fino alla senescenza replicativa. Tale pressione proliferativa aumenta la probabilità di eventi aberranti dovuti all’inserzione del transgene.
Sebbene i risultati dei test nel complesso portino a escludere un potenziale tumorigenico nelle cellule corrette, è necessario continuare gli studi per lo sviluppo di un saggio in vitro d’elezione che valuti in maniera univoca il rischio di genotossicità legato all’utilizzo di vettori RV. Alla luce di ciò, i dati più consistenti in termini di sicurezza sono rappresentati dalle indagini in vivo eseguite su campioni di cute prelevati dalle zone trapiantate delle due precedenti sperimentazioni cliniche confermate ulteriormente dal follow-up di un terzo paziente recentemente trapiantato che ha attestato una corretta e stabile espressione del transgene non associata ad alcun evento avverso o alterazione istologica della cute trapiantata.
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