Riassunto analitico
Storicamente, i campi della biologia strutturale e della fisiologia hanno trascurato l’approccio tipico della scienza dei materiali per lo studio dei sistemi biologici. Tuttavia, l’indagine delle proprietà fisiche – meccaniche e termodinamiche, ma anche ottiche e/o magnetiche – della materia biologica e del modo in cui queste caratteristiche rispondono alla modifica di fattori ambientali, può consentire di capire in modo più approfondito i processi funzionali e fisiologici che avvengono dalla nanoscala alla macroscala. La necessità di un approccio biofisico deriva, in parte, anche dai progressi effettuati nel campo della medicina rigenerativa e, più in generale, nelle ricerche su biomateriali che devono interagire col corpo in un modo specifico e predicibile. In parallelo, lo sviluppo di nuove tecnologie – sia dal punto di vista teorico/computazionale che sperimentale – ha concesso nuovi strumenti per lo studio approfondito delle proprietà più strutturali dei sistemi biologici, dalle cellule, ai tessuti, ad interi organi. In questo lavoro sperimentale, la microscopia a forza atomica (AFM) – insieme ad altre tecniche complementari, come l’aspirazione con micropipette (MAT) e la spettroscopia infrarossa (FTIR) – vengono impiegate per studiare e caratterizzare le proprietà meccaniche e termodinamiche di sistemi biologici diversi, in relazione allo specifico target di applicazione, che spazia, in questo caso, dalla farmacologia, alla medicina rigenerativa, all’ingegneria tissutale. Dopo un’introduzione nella quale vengono specificate le principali motivazioni e viene tracciato il quadro dello stato dell’arte (Capitolo 1), viene affrontata la descrizione dei campioni biologici investigati (Capitolo 2) e delle tecniche sperimentali utilizzate (Capitolo 3). I metodi e i protocolli impiegati sono riportati in dettaglio nel Capitolo 4. Nel Capitolo 5 sono presentati i risultati relativi all’effetto di molecole di interesse farmacologico e in particolare neurosteroidi (allopregnanolone (Allo), isoallopregnanolone (isoAllo) e pregnenolone solfato (Preg-S)) su modelli di membrana biologica. Le variazioni delle proprietà meccaniche e termodinamiche sono contestualizzate nell’ambito dell’ipotesi dei lipid rafts. Nel Capitolo 6, le proprietà enantiospecifiche dei bilayer lipidici vengono valutate studiando l’effetto degli enantiomeri dei neurosteroidi impiegati (ent-Allo e ent-isoAllo) su modelli di membrana biologica. Il Capitolo 7 riguarda l’effetto dei neurosteroidi Allo e dehydroepiandrosterone (DHEA) – che hanno una provata funzione neuroregenerativa – su cellule rilevanti per il funzionamento del sistema nervoso centrale, sia per quanto riguarda la riorganizzazione delle strutture citoscheletriche, sia per ciò che concerne una modificazione delle proprietà meccaniche. Il Capitolo 8 è relativo allo studio di strutture di fibrina+cheratinociti di interesse per la medicina rigenerativa e, in particolare, per il trapianto della cornea. La caratterizzazione meccanica viene effettuata utilizzando, in questo caso, il modello poroelastico e i dati derivanti dagli esperimenti di indentation modulation. Infine, nel Capitolo 9 sono riassunti i principali risultati ottenuti e vengono delineate le possibili future prospettive di indagine.
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Abstract
Historically, the fields of structural biology and physiology have tended to overlook materials-science approaches when investigating biological matter. However, studies of the physical - mechanical and thermodynamical, but also optical and/or magnetic - properties of biological systems and the investigation of how these features responds to changing environmental factors, provides opportunities to improve understanding of functional and physiological processes at all scales, from molecular and nanoscale to the
macroscale.
The emergence of biological materials science is due, in part, to the advent of regenerative medicine, as this discipline needs biomaterials that interact with the body in a specific, predictable manner. In parallel, the development of new technologies - both theoretical/computational and experimental - allows researchers the possibility to use new tools to study, in great detail, the structural properties of biological materials, whether cells,
tissue samples or complete organs.
In this experimental work we exploit Atomic Force Microscopy (AFM) - combined with other different and complementary techniques, like Micropipette Aspiration Technique (MAT) and Fourier Trasformed Infrared Spectroscopy (FTIR) - to study and characterize different biological samples, in order to have a better insight on their mechanical and thermodynamical properties, according to the specific target of application, which spaces from pharmacology to regenerative medicine and to tissue engineering.
After an introduction where the state of the art and the main motivations for this work are pointed out (Chapter 1), we present and describe the investigated materials (Chapter 2), as well as the employed experimental techniques (Chapter 3). The complete methods and protocols used for our characterization are reported in Chapter 4. In Chapter 5 we present the results concerning the effect of molecules of pharmacological interest like neurosteroids (allopregnanolone (Allo), isoallopregnanolone (isoAllo), pregnenolone sulfate (Preg-S)) on model lipid membranes. Mechanical and thermodynamical modification due to the presence of the neurosteroids are remarked and contextualized in the framework of the raft hypothesis. In Chapter 6 the effects of neurosteroids' enantiomers (ent-Allo and ent-isoAllo) on model lipid bilayers are studied in order to evaluate the enantiospecific properties of the membrane. Chapter 7 deals with the effects of the neurosteroids Allo and dehydroepiandrosterone (DHEA) - which are proved to have a neuroregenerative function - on cells relevant for the central nervous system, whether regarding the cytoskeleton reorganization or modifications in the mechanical properties.
Chapter 8 deals with the topographical and mechanical characterization of fibrin+keratinocytes samples for regenerative medicine and, in particular, for corneas transplantations. Data emerging from the characterization of the bare fibrin are for the first time analyzed in the context of the poroelastic theory and indentation modulation measurements are also presented. Finally, in Chapter 9 the results obtained in this work are briefly summarized and the main conclusions are presented, as well as future perspectives.
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