Riassunto analitico
I Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) sono noti per riconoscere cellule tumorali autologhe in modo dipendente dalla presentazion dell’antigene su molecole MHC-I. Il proteasoma e l'immunoproteasoma (IP) sono importanti per la presentazione dell'antigene in quanto producono antigeni proteici da presentare sulla superficie cellulare. In precedenza i nostri collaboratori (dati non pubblicati) hanno dimostrato che l'IP è up-regolato nel nucleo di sferoidi multi-cellulari generati utilizzando le piastre Ultra-Low Attachment (ULA). In questo studio, abbiamo mirato a indagare se l'over-espressione dell’IP possa influenzare il riconoscimento del tumore. Per studiare questo, abbiamo usato coppie autologhe di cellule tumorali e TIL. Abbiamo confrontato il riconoscimento di cellule tumorali cresciute in sferoidi e cresciute in fiasche da parte dei TIL autologhi per dimostrare che gli sferoidi sono più immunogenici delle cellule in fiasca misurando la produzione di citochine (IFN-γ), la degranulazione (CD107a) o l'uccisione (51Cr). Abbiamo osservato che gli sferoidi generati da un basso numero iniziale di cellule (5.000 e 10.000) sono i più immunogenici, ma che diverse dimensioni di sferoidi stimolano risposte diverse da parte dei TIL ottenuti da diversi pazienti. Per dimostrare il ruolo dell'IP nel riconoscimento del tumore, abbiamo stimolato o inibito l'espressione dell'IP nelle cellule tumorali cresciute come sferoidi e o in fiasche. La stimolazione dell'IP tramite il trattamento con IFN-γ ha mostrato che è possibile indurre una maggiore immunogenicità nelle cellule cresciute in fiasche, e anche leggermente negli sferoidi, quando si stimola l'IP con IFN-γ. Inoltre, l'inibizione del proteasoma usando Bortezomib ha mostrato una riduzione dell'immunogenicità di due volte sulle cellule tumorali cresciute in fiasche, mentre ha avuto un impatto minore sugli sferoidi. Oltre alle linee cellulari di melanoma che crescoo in adesione, abbiamo dimostrare che è possibile crescere e generare sferoidi anche da linee cellulari tumorali generate a partire da tumori liquidi, come RAJI e K562 ( rispettivamente Linfoma di Burkitt e Leucemia mieloide).
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Abstract
Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) are known to recognize the autologous tumor in a MHC-I-antigen dependent manner. The proteasome and the immunoproteasome (IP) are important for the antigen presentation due to their function to produce antigens/peptides out of proteins to generate antigens to be presented on the cell surface. It has previously been shown by our collaborators (unpublished data) that the IP is upregulated in the core of multi-cellular spheroids generated using Ultra-Low Attachment plates (ULA). In this study, we aimed to investigate whether the up-regulation of the IP could affect tumor recognition. To study this we used autologous tumor-TIL pairs. We compared recognition by autologous TIL of tumor cells grown in spheroids and grown in flask to prove that spheroids are more immunogenic than flask cells by measuring cytokine production (IFN-γ), degranulation (CD107a) or killing (51Cr). We observed that spheroids generated form a low starting number of cells (5.000 and 10.000) are most immunogenic but that different sizes of spheroids stimulate different responses by the TIL from different patients. To demonstrate the role of the IP in tumor recognition, we either stimulated or inhibited the IP expression in the tumor cells grown in spheroids and in flasks. Stimulation of the IP via IFN-γ treatment showed that it is possible to induce a higher immunogenicity in flask cells, and slightly also in spheroids, when stimulating the IP with IFN-γ. Further, inhibition of the proteasome with Bortezomib showed a 2-decrease in immunogenicity on tumor cells grown in flask but had a lower impact on spheroids. In addition to adherent melanoma cell lines we could also show that it is possible to grow and generate spheroids from commercial cancer cell lines of liquid tumors such as RAJI and K562 (Burkitt lymphoma and myelogenous leukaemia, respectively).
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