Riassunto analitico
Identificate 50 anni fa, le cellule stromali/staminali mesenchimali (CSM) hanno generato subito grande interesse nella comunità scientifica per la loro plasticità e la funzione di supporto ematopoietico. Il midollo osseo (MO) è considerato un’importante fonte di CSM aderenti alla plastica utilizzate per la rigenerazione dei tessuti, soprattutto in campo ortopedico. Tuttavia, la bassa efficienza di isolamento e la necessità di numeri elevati per le applicazioni cliniche richiedono fonti di isolamento alternativi. Nella frazione non aderente di colture murine e umane da MO (Dominici M et al PNAS 2004; Di Maggio N et al Stem Cells 2012)sono stati individuati progenitori mesenchimali non aderenti (NAMP) che possono essere mantenuti ed espansi in sospensione, rappresentando una probabile popolazione di progenitori precoci capaci di generare ex vivo progenitori in adesione (AMP). Per avere maggiori informazioni su questa popolazione, abbiamo raccolto e riseminato le NAMP da culture di MO, confermando la loro capacità di generare AMP. Queste cellule hanno dimostrato in vitro la stessa capacità differenziativa in osso delle classiche CSM e un sorprendente aumento dell'espressione di SSEA4, marker delle cellule staminali embrionali umane. È interessante notare che le prime due frazioni di AMP hanno mostrato un significativo aumento del fattore di crescita b-FGF e una maggiore espressione della proteina B7 (HOXB7). Questi risultati ricordano i dati riportati dal nostro gruppo (Candini O et al. Stem Cells 2015) sul legame dell'espressione di HOXB7 nelle classiche CSM e l'aumento della produzione di bFGF associata ad una maggiore prestazione delle stesse cellule modificate. In base a questi dati, ci siamo chiesti se l'espressione indotta dal gene HOXB7 nelle CSM potesse trasformare queste cellule in "bioreattori viventi" in grado di influenzare anche le CSM non modificate, grazie alla secrezione di mitogeni come bFGF e imitando artificialmente il sistema NAMP-CSM qui descritto. Abbiamo così utilizzato il mezzo condizionato delle CSM modificate con HOXB7 contenente livelli rilevanti di bFGF (200 volte in più per HOXB7 rispetto a GFP) con le CSM non modificate (rapporto 3:1) osservando variazioni nella crescita cellulare e nei parametri fisici al FACS (SSC e FSC). Abbiamo quindi co-coltivato CSM-WT con CSM-HOXB7 mostrando una proliferazione maggiore rispetto alla co-coltura di CSM-WT con CSM-GFP. Dopo 10 giorni di co-coltura, il rapporto 1:1 di cellule GFP-/GFP+ è stato mantenuto per CSM-WT+CSM-HOXB7, suggerendo che entrambe le popolazioni contribuiscono all'aumentata crescita. La co-coltura con CSM-HOXB7 è stata associata ad un cambiamento dei parametri morfologici (FSC/SSC al FACS) delle CSM-WT: cellule più piccole e meno complesse dei controlli. L'effetto è stato reversibile e dopo un passaggio dal sorting, le modificazioni acquisite durante la co-coltura sono state perse. Nel differenziamento in vitro, la co-coltura CSM-WT+CSM-HOXB7 ha evidenziato un significativo differenziamento osteogenico rispetto a CSM-WT+GFP, CSM-HOXB7 o CSM-WT. Questi risultati e le possibili implicazioni cliniche ci hanno spinto a verificare l'impatto in vivo delle CSM-HOXB7 in un modello xenogenico di rigenerazione ossea (Murgia A et al PLOS One 2016) confermando l'importanza di CSM-HOXB7 nella formazione dell’osso. Trasferendo questo concetto nella rigenerazione tissutale, la riprogrammazione delle CSM con HOXB7 potrebbe aumentare i loro potenziali rigenerativi, ottenendo un drammatico aumento del loro potenziale osteogenico attraverso un meccanismo ancora inesplorato di “effetto spettatore” su se stesse e sulle cellule vicine. Questa strategia da vita ad un nuovo approccio per migliorare le principali funzionalità delle CSM, come la proliferazione e la rigenerazione ossea, suggerendo che la modifica delle CSM con HOXB7 potrebbe generare nuove opzioni terapeutiche nella rigenerazione scheletrica.
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Abstract
Identified 50 years ago, mesenchymal stromal/stem cells (MSC) were immediately generating a relevant interest in the scientific community for their differentiation plasticity and the hematopoietic supportive function. Bone marrow (BM) is considered an important source of plastic adherent MSC used for tissue regeneration, in particular in the orthopedic field. However, their low isolation efficiency and the need of relevant numbers for clinical applications still demand for alternative isolation methods and sources. An additional source of mesenchymal progenitors has been described in the non-adherent fraction of murine and human BM cultures (Dominici M et al PNAS 2004; Di Maggio N et al Stem Cells 2012). These cells, defined as non-adherent mesenchymal progenitors (NAMP), can be maintained and expanded in suspension possibly representing an unexpected population of early progenitors capable to ex vivo originate adherent MSC progenitors (AMP). In order to provide greater insights on this population, we begun to collect and re-plate NAMP cells from BM cultures confirming that NAMP could generate AMP. These cells showed in vitro the same skeletal differentiation capacity of the classical MSC and a surprising increase in the expression of SSEA4, a marker of human embryonic stem cells. Interestingly, the first two AMP fractions revealed a significant increase of basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF) together with a greater homeobox B7 protein (HOXB7) expression. These findings recalled the data reported by our group (Candini O et al. Stem Cells 2015) on the link of HOXB7 over-expression in classical MSC and the increase of their bFGF production consequently associated with a greater performance of the transformed cells themselves. Based on these considerations, we asked whether the gene-induced expression of HOXB7 in MSC could transform these cells in “living bioreactors” capable to impact also on non-modified MSC by the secretion of mitogens like bFGF, and in this way somehow artificially mimicking the NAMP-MSC interplay here described. Thus, we challenge the conditioned medium of HOXB7 modified MSC, containing relevant levels of bFGF (200 fold increase of HOXB7 compared to GFP) with non-modified MSC (ratio 3:1), observing variations in their cell growth and FACS-based physical parameters (SSC and FSC). We have then co-cultured MSC-WT with MSC-HOXB7 showing a higher proliferation compared to the co-culture of MSC-WT with MSC-GFP. After 10 days of co-culture the 1:1 ratio of GFP positive/GFP negative cells was maintained for the combination MSC-WT+MSC-HOXB7 suggesting that both populations contribute to the increased growth rate. The co-culture with MSC-HOXB7 was interestingly associated with a change in MSC-WT morphological (FSC/SSC by FACS) parameters: smaller and less complex cells than the controls. The effect was reversible and, after one passage from sorting, modifications acquired during co-culture were lost When differentiated in vitro, the co-culture MSC-WT+MSC-HOXB7 revealed a significant increase of skeletal commitment compared to MSC-WT+MSC-GFP and MSC-HOXB7 or MSC-WT taken individually. These findings and their possible clinical implications led us to verify the in vivo impact of MSC-HOXB7 in a xenogenic model of bone regeneration (Murgia A et al. PLOS One 2016) confirming the importance of MSC-HOXB7 in bone formation. Transferring this concept into tissue regeneration, we can state that reprogramming MSC by HOXB7 could increase their regenerative potentials, obtaining a dramatic increase of their osteogenic potential via a still unexplored by-stander mechanism on themselves and on neighbor cells. This strategy originates a novel approach to enhance pivotal MSC features, such as proliferation and skeletal regeneration, suggesting that modifying MSC by HOXB7 could generate novel therapeutic options in skeletal regeneration.
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