• CD271
• cellule staminali
• cSCC
• neurotrofine
• sferoidi

Il carcinoma squamo cellulare cutaneo (cSCC) è il secondo tumore cutaneo più comune e rappresenta circa il 20% di tutte le neoplasie cutanee. Sebbene la maggior parte dei casi presenti un basso rischio di complicazioni e sia trattabile con la chirurgia, una parte dei tumori mostra un comportamento aggressivo, caratterizzato da metastasi e prognosi sfavorevole.
Un elemento chiave nell’aggressività del tumore è rappresentato dalle cellule staminali tumorali (CSCs), che promuovono l’iniziazione del tumore e contribuiscono alle recidive, fungendo da riserva per la ricrescita e la resistenza alle terapie. Nel cSCC, le CSCs possono essere isolate grazie alla loro elevata espressione di integrina-β1. I cheratinociti con i livelli più alti di integrina-β1, detti cellule a rapida adesione (RAD), generano tumori più aggressivi, con una maggiore capacità migratoria e iperproliferazione rispetto alle cellule a non rapida adesione (NRAD).
Le neurotrofine (NTs) e i loro recettori (NTRs) regolano la crescita e la differenziazione epidermica. Studi precedenti hanno dimostrato che il recettore a bassa affinità per le NT CD271 è poco rilevabile nei tumori primari scarsamente differenziati (MD-PD), mentre l’espressione dei recettori ad alta affinità Trk (TrkA, TrkB, TrkC) ne promuove la proliferazione. Inoltre, CD271 può influenzare il microambiente tumorale: le cellule di cSCC che overesprimono CD271 aumentano la migrazione e il reclutamento dei monociti sia in vitro che in vivo.
Alla luce di questo background, ipotizziamo che NTs e i loro recettori, in particolare TrkA e CD271, influenzino la crescita del cSCC e il microambiente infiammatorio. Per approfondire questi aspetti, abbiamo utilizzato modelli 3D per studiare il loro ruolo nella progressione tumorale. In particolare, abbiamo isolato e caratterizzato le sottopopolazioni RAD e NRAD da cellule primarie di cSCC e linee cellulari per generare sferoidi. I nostri esperimenti hanno mostrato che gli sferoidi RAD formano strutture più vitali e invasive in matrici di collagene, mentre gli sferoidi NRAD presentano un numero maggiore di cellule apoptotiche e invasione limitata.
Con la linea cellulare SCC13, abbiamo valutato l’espressione dei NTRs, concentrandoci sui recettori CD271 e TrkA. La downregolazione di CD271 ha aumentato significativamente l’area degli sferoidi RAD, mentre la sua sovraespressione o la downregolazione di TrkA (mediante siRNA o con l’inibitore K252a) hanno ridotto l’area degli sferoidi RAD.
Per validare ulteriormente i nostri risultati, abbiamo esaminato sferoidi derivati da cellule di pazienti con cSCC. Abbiamo osservato che CD271 è più espresso nelle cellule NRAD, a supporto del loro stato differenziato e la maggiore suscettibilità all’apoptosi, soprattutto nei cSCC ben differenziati (WD). Tuttavia, nei tumori avanzati, i livelli di CD271 sono bassi sia nelle cellule RAD che NRAD. Al contrario, gli sferoidi RAD esprimono livelli più elevati di TrkA, a conferma del loro maggiore potenziale proliferativo.
Infine, abbiamo utilizzato sferoidi derivati da linee cellulari di cSCC e da cellule primarie di pazienti con cSCC per confermare il ruolo di CD271 nel reclutamento dei monociti THP-1. Gli sferoidi con sovraespressione di CD271 hanno aumentato significativamente il richiamo dei monociti in entrambe le sottopopolazioni. Questi monociti esprimono alti livelli di mRNA di citochine pro-infiammatorie, come TNF-α e IL-1β, suggerendo una differenziazione verso un fenotipo M1.
In sintesi, questi risultati sottolineano l’utilità del modello 3D di sferoide per studiare il cSCC e come strumento per indagare le caratteristiche staminali delle cellule RAD, somiglianti alla popolazione iniziatrice del tumore. Inoltre, confermano il ruolo chiave di CD271 nella modulazione del comportamento tumorale e nell’interazione con il sistema immunitario, aprendo nuove prospettive per strategie terapeutiche mirate al trattamento del cSCC.

Cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC) is the second most common skin cancer, accounting for approximately 20% of all cutaneous tumors. While the majority of cSCC present low-risk of developing complications and can be treated with surgery, a subset of tumors exhibit aggressive behavior, characterized by metastatic potential, leading to poor clinical outcomes. A critical factor for tumor maintenance and aggressiveness is the presence of cancer stem cells (CSCs), which drive tumor initiation and contribute to its recurrence by serving as a reservoir for regrowth and therapy resistance. In cSCC, CSCs can be isolated according to their elevated expression of ꞵ1-integrin. In fact, cSCC keratinocytes expressing the highest levels of ꞵ1-integrin, called rapid adhering (RAD) cells, can generate more aggressive tumors, characterized by enhanced migratory capacity and hyperproliferation as compared to non-rapid adhering (NRAD) cSCC cells. In the skin, neurotrophins (NTs) and their receptors (NTRs) are important regulators of epidermal growth and differentiation in healthy and pathological conditions. The common NT receptor CD271 is scarcely detectable in moderately and poorly differentiated (MD-PD) primary tumors. Conversely, the high affinity Trk (TrkA, TrkB and TrkC) receptor expression promotes proliferation. CD271 is also able to influence cSCC microenvironment. Recently, it has been shown that the CD271-overexpressing cSCC cells are able to increase the recruitment and migration of monocytes both in vitro and in vivo. Considering the given background, we hypothesize that NTs and their receptors, particularly TrkA and CD271, influence cSCC growth and its inflammatory microenvironment and we set up different 3D models to better understand their contribution to tumor progression. Using primary cSCC cells and cSCC cell lines, we isolated and characterized RAD and NRAD subpopulations to generate spheroids. Our experiments revealed that RAD and NRAD spheroids exhibited specific behaviors: RAD spheroids formed more vital structures and demonstrated enhanced invasion capacity in collagen matrices, while NRAD spheroids were more differentiated, with a higher number of apoptotic cells, and showed limited invasion. Next, we used the SCC13 cell line to evaluate the expression and functions of NTRs in the two subpopulations, focusing on CD271 and TrkA. CD271 downregulation increases the total area of the RAD spheroids. Conversely, CD271 overexpression and the TrkA downregulation (with siRNA or the TrkA inhibitor K252a) led to a significant decrease in RAD spheroid total area. To validate these findings, we examined patient-derived cSCC spheroids. CD271 expression was higher in NRAD cells, reflecting their more differentiated state and increased susceptibility to apoptosis. This correlation between CD271 expression and spheroid growth was particularly evident in well-differentiated (WD) cSCC. In contrast, more advanced tumors showed low levels of CD271 in both RAD and NRAD spheroids. On the other hand, RAD spheroids expressed higher levels of TrkA, supporting their enhanced proliferative potential. Finally, we used cSCC cell line and cSCC patients-derived spheroids to confirm CD271 ability in promoting immune cells recruitment towards RAD and NRAD subpopulations. CD271-overexpressing spheroids increased the recruitment of THP-1 monocytes as compared to controls in both RAD vs NRAD spheroids. In particular, these monocytes highly expressed pro-inflammatory cytokines mRNA, such as TNF-α and IL-1ꞵ, which suggested a M1 phenotype differentiation. Altogether, these findings support the 3D spheroid model as a useful tool to study cSCC and highlight the stem-like characteristics of RAD cells and their resemblance to the tumor-initiating population of CSCs. Finally, we confirm CD271's important role in modulating tumor behavior and immune interaction, providing new insights into potential therapeutic strategies for managing cSCC.