Riassunto analitico
L’organizzazione Mondiale della Sanità ha inserito diciassette patologie croniche invalidanti nella categoria delle “malattie tropicali neglette” (NTDs), a causa dello scarso interesse da parte delle case farmaceutiche. Tra queste patologie troviamo la Leishmaniosi (Leishmania) e la Tripanosomiasi Africana umana (Trypanosoma brucei). I farmaci in uso per queste patologie sono tossici, costosi e spesso di difficile somministrazione, inoltre, sono vecchi e con il tempo hanno causato problemi di farmaco-resistenza. Questo lavoro di tesi è parte di un progetto europeo più ampio, chiamato “New Medicines for Trypanosomatidic Infections” (NMTrypI n° 603240), che si occupa dello sviluppo di molecole efficaci e non tossiche, da utilizzare per le NTDs. I farmaci che hanno come target le proteine del metabolismo dei folati, non mostrano però efficacia nei confronti dei tripanosomatidi, in quanto gli inibitori della diidrofolato reduttasi (DHFR) inducono processi di sovraespressione della pteridina reduttasi (PTR1) che permette di bypassare il blocco della DHFR. La DHFR è nota da tempo come target dei farmaci antimalarici più noti, tra cui la pirimetamina. Nell’ambito di infezioni come la Leishmaniosi e la Tripanosomiasi, il metabolismo dei folati ha un ruolo importante e in particolare due enzimi che catalizzano reazioni simili: PTR1 e DHFR. L’enzima PTR1 è presente solo nei tripanosomatidi ed è capace di catalizzare quattro reazioni enzimatiche, due delle quali sono le stesse catalizzate dalla DHFR. La ricerca è incentrata nell’individuare molecole che inibiscono sia la PTR1, che la DHFR parassitarie (inibitori duali) oppure molecole in grado di inibire in modo selettivo la PTR1, per poi combinarle con un farmaco che va ad agire sulla DHFR. A tal fine, in collaborazione con la Tydock Pharma, è stata progettata e sintetizzata una serie di molecole a struttura pteridinica, analoghe del folato che competono con il substrato, in modo da inibire l’enzima e sviluppare azione antiparassitaria. I farmaci verso le infezioni da tripanosomatidi devono avere un profilo chimico-biologico che viene definito Target Product Profile (TPP) specifico per la classe di composti in esame. Lo scopo del mio lavoro di tesi è stato quello di selezionare i composti con migliore efficacia inibitoria verso la PTR1, in modo da delineare il migliore profilo enzimatico e determinare la tossicità verso diverse linee cellulari di mammifero, in quanto ospite del parassita. Inoltre, le diverse linee cellulari sono state trattate con la pirimetamina e il metotrexato. Per raggiungere tale scopo ho svolto le seguenti attività: ì) purificazione e caratterizzazione delle proteine LmPTR1, TbPTR1, LmDHFR-TS, hTS, hDHFR, espresse in E. coli; ìì) test di screening dei composti sulle proteine purificate; ììì) test di citotossicità su diverse linee cellulari modello: WRL 68 (linea epatica umana), HepG2 (linea di epatocarcinoma umano), NIH 3T3 (linea di fibroblasti murini), A2780 (linea di tumore ovarico umano). I composti testati hanno mostrato una buona attività nei confronti della proteina TbPTR1 con una IC50 di circa 1-50 nM e della proteina LmPTR1 con una IC50 di circa 1 µM, rispetto all’inibizione nei confronti delle proteine umane, verso le quali i composti hanno un valore di IC50 circa 10-100 volte superiore. Inoltre, la maggior parte dei composti ha mostrato una minore tossicità sulle diverse linee cellulari di mammifero, rispetto ai farmaci di riferimento. I composti pteridinici rappresentano un promettente risultato in termini di capacità di inibizione e selettività nei confronti delle proteine parassitarie e di una bassa citotossicità. I dati ottenuti, integrati con dati preliminari non ancora pubblicati, sono confrontabili con il Target Product Profile, che permette di selezionare i composti migliori per ulteriori studi di farmacocinetica.
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Abstract
World Health Organization has included seventeen chronic disabling infections in the category of “Neglected Tropical Diseases” (NTDs), due to the lack of interest by pharmaceutical companies. These diseases affect more than one billion people worldwide, in particular those living in the poorest areas of the world, inducing thousands of deaths every year.
These diseases include Leishmaniasis (Leishmania) and Human African Trypanosomiasis (Trypanosoma brucei). Nowadays current drugs targeting these NTDs are toxic, expensive, and often difficult to administer; moreover, actually available medicines are outdated and present an increased drug resistance.
This work is part of a European larger project, called “New Medicines for Trypanosomatidic Infections” (NMTrypI n° 603240), which deals with the development of new, effective, non-toxic molecules for NDTs.
Drugs that target the proteins of the folate pathway proved not to be effective against trypanosomatids, because dihydrofolate reductase (DHFR) inhibitors induce the over-expression of the enzyme pteridine reductase (PTR1), that allows to overcome the block of DHFR. Since long time, DHFR was the target of the best-known antimalarial drugs, such as pyrimethamine (PYR).
In infections context, as Leishmaniasis and Trypanosomiasis, the folate pathway, in particular two enzymes that catalyse similar reactions PTR1 and DHFR, plays an important role.
PTR1 enzyme is an NADPH-dependent dehydrogenase/reductase only presents in trypanosomatids; it is able to catalyse four reactions, and two of these are the same reactions catalysed by DHFR.
The research aims to identify new molecules that inhibit both parasitic PTR1 and DHFR (dual inhibitors), or molecules able to selectively inhibit PTR1, to combine them with known drugs acting on parasite’s DHFR.
In collaboration with Tydock Pharma, a series of pteridinic molecules, folate analogues that compete with the substrate, has been designed and synthesized to inhibit the enzyme and to develop antiparasitic action.
Drugs for trypanosomatidic infections must have a chemical-biological profile defined Target Product Profile (TPP), specific for the class of test compounds.
The aim of the study was to select the compounds with the better inhibitory effect against PTR1, to delineate the best enzymatic profile and to determine their toxicity against different mammalian cell lines that are the host cells of the parasite. Moreover, mammalian cell lines were treated with an antiparasitic drug, PYR, and methotrexate (MTX) used to compare the pteridine compounds’ toxicity with that of known drugs.
To achieve the aim of the work, the laboratory activities performed included:
i) purification and characterization of proteins LmPTR1, TbPTR1, LmDHFR-TS, hTS, hDHFR, expressed in E. coli;
ii) screening test of the compounds against the purified proteins;
iii) cytotoxicity test against different cell lines: WRL 68 (Human liver embryonic cell line), Hep G2 (Human hepatocellular liver carcinoma cell line), NIH 3T3 (Mouse embryonic fibroblast cell line), A2780 (Human ovarian cancer cell line);
iv) data analysis.
The pteridine compounds tested showed a good activity against the protein TbPTR1 with an IC50 of about 1-50 nM and against LmPTR1 with an IC50 of about 1 µM. Indeed compounds activity against the human proteins presented an IC50 value from 10 to 100 times higher than the previous ones. Furthermore, the majority of compounds have shown lower toxicity towards the different mammalian cell lines, with respect to PYR and MTX. Finally, pteridine compounds showed promising results in terms of inhibition capacity and selectivity against parasitic proteins and of low cytotoxicity. The data obtained, integrated with our unpublished preliminary data, are comparable with the Target Product Profile that allows to select the best compounds for further pharmacokinetic studies.
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