Riassunto analitico
La tripanosomiasi africana umana (HAT) è un'infezione parassitaria trasmessa da un vettore, la mosca tse-tse e causata da un protozoo extracellulare appartenente al genere Trypanosoma, specie brucei. La malattia si presenta come antroponosi e come zoonosi. Per questo viene considerata all’interno del principio One Health. La malattia si sviluppa in due fasi, la prima coinvolge il sistema linfatico e sanguigno e la seconda il sistema neurologico e, se non trattata può progredire fino alla morte. In assenza di un vaccino, il controllo della malattia si basa sull'individuazione e sul trattamento dei casi e sul controllo dei vettori. I farmaci attualmente disponibili presentano diverse problematiche, tra cui la tossicità, il costo, la difficoltà di somministrazione e lo sviluppo di resistenza, ma gli studi clinici in corso fanno sperare in trattamenti più sicuri e più semplici. Una via biochimica sfruttata nel trattamento delle Tripanosomiasi è la via metabolica dei folati. I protozoi tripanosomatidi sono auxotrofi per i folati e le pterine. L’acido folico e la biopterina, una volta assorbite dall’ambiente esterno, subiscono due successive riduzioni per ottenere la forma biochimicamente attiva. Due principali proteine sono coinvolte in questo metabolismo: la pteridina reduttasi 1 (PTR1) e la diidrofolato reduttasi (DHFR). Quando si inibisce la DHFR, la PTR1 è sovra espressa e può assumere il ruolo della DHFR assicurando, così, la sopravvivenza del parassita. Per questo motivo, una terapia di successo potrebbe essere ottenuta solo quando sia DHFR che PTR1 saranno inibiti contemporaneamente da un singolo farmaco o da due farmaci somministrati in combinazione. Il presente lavoro di tesi sperimentale, svolto nel Laboratorio di Drug Discovery and Biotechnology della Prof.ssa Maria Paola Costi, si prefigge l’obiettivo di individuare nuovi potenziali candidati che inibiscano sia PTR1 che DHFR-TS, da impiegare nel trattamento della HAT. Il mio progetto di tesi si colloca all’interno della early phase del processo di drug discovery in cui i composti individuati inizialmente devono essere valutati verso il target selezionato, su modelli semplici quali gli enzimi purificati. A tale scopo, ho studiato 14 composti a struttura benzimidazolica, preventivamente progettati e sintetizzati per essere attivi verso gli enzimi TbDHFR-TS e TbPTR1. Lo scopo era quello di selezionare quale di questi composti mostrava il miglior effetto inibitorio contro i due enzimi, per comprendere le relazioni struttura-attività e delineare lo scaffold migliore da utilizzare come lead compound. Durante il mio lavoro di tesi, mi sono occupata dei seguenti aspetti: i) purificazione e caratterizzazione delle proteine TbPTR1, TbDHFR-TS e hTS, espresse in E. coli DE3; ii) saggi di inibizione dei composti contro le proteine purificate; iii) saggi di citotossicità dei composti contro la linea cellulare THP-1 di macrofagi umani, infettati da T. brucei; iv) selezione dei composti migliori utilizzando i dati disponibili e utilizzo di software di modellistica molecolare per ispezione del sito attivo. Dai risultati ottenuti si è osservato che ciascun inibitore inibisce TbPTR1 e TbDHFR-TS in modo selettivo, preferenzialmente verso TbDHFR-TS. Inoltre, ho testato i composti verso l’enzima hTS ricombinante e non si è osservata alcuna attività off-target significativa. Successivamente, i composti sono stati impiegati per studi di citotossicità contro la linea cellulare THP-1 di macrofagi umani. I dati ottenuti hanno mostrato una scarsa attività citotossica dei composti per la linea cellulare. Quindi, possiamo affermare che alcuni di questi composti potrebbero essere dei promettenti inibitori di successo per lo sviluppo di nuovi farmaci per le Tripanosomiasi.
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