Riassunto analitico
L’Organizzazione Mondiale della Sanità stima in più di 3 miliardi le persone a rischio di contrarre malattie parassitarie come la Tripanosomiasi Africana, il Morbo di Chagas o le Leishmaniosi. I farmaci attualmente in uso presentano numerose limitazioni a causa della loro tossicità, efficacia, costo e insorgenza di resistenze. Si avverte, perciò, la necessità di nuovi farmaci efficaci per trattare queste patologie. I tripanosomatidi sono auxotrofi per i folati e hanno evoluto un complesso meccanismo di recupero e riutilizzo di substrati a struttura pteridinica. L’enzima diidrofolato reduttasi (DHFR) rappresenta un target fondamentale in quanto serve per la sintesi dell’acido tetraidrofolico, essenziale per il funzionamento di proteine coinvolte nella replicazione cellulare. La DHFR rappresenta un bersaglio importante per la terapia contro la malaria, e può essere interessante anche per infezioni da tripanosomatidi se non si avesse un rapido sviluppo di resistenza a causa della sovraespressione della Pteridina Reduttasi-1 (PTR1). Costitutivamente, la PTR1 è coinvolta nella riduzione delle biopterine e solo per il 10% dell’acido folico, ma la sua sovraespressione garantisce sufficiente apporto di tetraidrofolato per la sopravvivenza del parassita. La simultanea inibizione di entrambi gli enzimi da parte di molecole ad attività duale o in combinazione con inibitori noti della DHFR, può rappresentare una valida strategia farmacologica. Il gruppo di ricerca presso il quale ho condotto questo lavoro di tesi si occupa di identificare nuovi inibitori della PTR1. Alcuni di questi composti, a struttura tiazolica, hanno mostrato costanti di inibizione (Ki) minori di 10 µM nei confronti degli enzimi target, un’elevata specificità in vitro rispetto agli enzimi umani ed una buona attività antiparassitaria in combinazione con la pirimetamina. Scopo di questo lavoro di tesi sperimentale in Biotecnologie Mediche e Farmaceutiche è la progettazione, sintesi e valutazione biologica di nuovi derivati a struttura benzotiazolica quali inibitori dell’enzima PTR1, al fine di implementarne il profilo di inibizione enzimatica e antiparassitario oltre che di tossicità ADME. I composti di nuova sintesi devono aderire al Target Product Profile, cioè al profilo previsto per ottenere un composto con le caratteristiche attese per passare dalla fase di hit (composto iniziale) alla fase di lead (composto attivo su più specie di parassita). Attraverso lo studio delle strutture cristalline, del sito catalitico ed un’analisi dei dati di attività di composti simili, sono stati progettati nuovi derivati del 2-amino-benzotiazolo mediante metodiche computazionali semplici al fine di valutarne semi-quantiativamente l’affinità di legame al sito catalitico. I composti con lo score migliore sono stati selezionati e 34 nuove molecole sintetizzate e caratterizzate. Tutti i composti sono stati testati al fine di valutare l’inibizione delle PTR1 parassitarie, il profilo ADME e la specificità verso enzimi umani off-target folato-dipendenti (hTS e hDHFR). I migliori composti hanno mostrato Ki<10 M e, da studi in vitro, un tollerabile profilo ADME. Tutte le molecole sintetizzate sono state inoltre saggiate come agente singolo e in combinazione con metotrexato rivelando buona attività antiparassitaria, selettività e sinergismo verso T. brucei. Delle nuove molecole, infine, 2 sono state cristallizzate in complesso ternario con TbPTR1-NADPH. Il modo di binding osservato nelle strutture cristalline rispecchia i risultati ottenuti dallo studio computazionale. Da questa indagine emerge come queste molecole a struttura non-folato simile aderiscono al profilo di TPP e rappresentano candidati promettenti per lo sviluppo di farmaci antiparassitari.
Questo lavoro di tesi si inserisce all’interno del progetto NMTrypI (progetto n°603240) supportato finanziariamente dall’Unione Europea nell’ambito del Settimo Programma Quadro. www.nmtryi.eu
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Abstract
According to World Health Organization (WHO) over three billion people in the world risk to contract parasitic diseases, such as African (sleeping sickness) and American (Chagas disease) trypanosomiasis and Leishmaniasis. Drugs currently in use have major limitations due to their toxicity, variable efficacy, cost and development of resistance. It is necessary to discover new targets and new drugs to treat these diseases. Trypanosomatids are folate auxotrophs and they evolved a complex and versatile pteridine salvage network capable of scavenging a wide array of conjugated and unconjugated pteridines. The Dihydrofolate Reductase (DHFR), an enzyme deputized in the synthesis of the tetrahydrofolic acid, an essential co-factor for the protein involved in the cellular division, could represent a valid target. Since antifolate are successful used as antimalaric drugs, the inhibition of the DHFR could be a promising strategy against tripanomastidic infections if we are able to avoid the rapidly onset of resistance due to the Pteridine reductase-1 (PTR1) overexpression. PTR1 is mainly involved in the reduction of biopterine and only for the 10% of folate; its overexpression provides the amount of folate necessary for the cell survival. Simultaneous inhibition of PTR1 and DHFR, thanks to dual-activity molecules or in combination with known DHFR inhibitors can lead to a promising pharmacological therapy. The research group, where I performed this thesis project, aims to discover and develop new PTR1 inhibitors. Among them, some thiazole-based compounds showed promising PTR1 inhibition at micro molar level, high in vitro specificity with the respect of human enzyme and promising antiparasitic activity in combination with pyrimetamine. Aim of this experimental thesis in Medical and Pharmaceutical Biotechnology is the design, synthesis and biological evaluation of new benzothiazoles as PTR1 inhibitors in order to obtain new candidate drugs with better enzymatic, antiparasitic and ADME-Tox profile. These new candidates must comply with the Target Product Profile, in order to obtain molecules that could enter in lead optimization phase.
Basing on a visual inspection of the crystallographic structures available, the study of the catalytic site and a cross analysis of similar compound, a set of new 2-amino-benzothiazoles were designed and analyzed first through docking analysis in order to evaluate the binding affinity with the target catalytic site. Compound showing good ranking score and pose were filtered and 34 brand-new benzothiazoles synthesized and characterized. All the synthesized compounds were evaluated for their capability to inhibit parasitic PTR1 in an enzymatic assay. The ADME profile and the capability to interact with other folate-dependent enzymes (hTS and hDHFR) has been also determined. From the screening, the compounds showed a good activity and selectivity against the target enzymes (Ki<10µM) and a safe in vitro ADME profile. All the compounds have been tested against the different parasites as single agents and in combination with methotrexate reveling a good antiparasitic activity, selectivity and synergy against T. brucei. Two new crystallographic structures were also obtained in a ternary complex with TbPTR1-NADPH and the poses support the docking analysis and the design. Some of these non-folate like molecules fit good with the TPP profile and are promising candidates for the development of new antiparasitic drugs. This thesis is part of the MTrypI (New Medicine for Trypanosomatidic Infections) project refunding from the European Union’s Seventh Framework Programme for research, technological development and demonstration under grant agreement n° 603240. www.nmtryi.eu
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