Riassunto analitico
I lieviti sono stati utilizzati nella fermentazione degli alimenti fin dall'antichità e sono ora essenziali nella produzione industriale di prodotti chimici, farmaceutici e di un'ampia gamma di prodotti metabolici, tra cui enzimi, vitamine, polisaccaridi capsulari e composti del DNA ricombinante. Svolgono un ruolo cruciale nei processi biotecnologici, in particolare nella produzione di bevande alcoliche, dove le cellule di lievito incontrano vari fattori di stress durante la fermentazione, come lo stress osmotico, le fluttuazioni di temperatura, l'esaurimento dei nutrienti e l'accumulo di metaboliti come l'etanolo.
In questa tesi, sono stati analizzati undici ceppi di lievito, tra cui nove ceppi di Saccharomyces cerevisiae e due ceppi non-Saccharomyces appartenenti alle specie Torulaspora delbrueckii e Metschnikowia pulcherrima. I ceppi, commercializzati da AEB S.p.A e conservati nella Unimore Microbial Culture Collection (UMCC), sono stati prima valutati attraverso test di microvinificazione. Dopo la fermentazione, sono stati misurati il pH e l'acidità titolabile e gli zuccheri, l'etanolo, il glicerolo e gli acidi organici sono stati quantificati mediante HPLC. Inoltre, in specifici test di microvinificazione, sono stati studiati gli effetti di vari additivi commerciali.
Lo studio ha inoltre valutato la tolleranza dei ceppi all'aumento delle concentrazioni di etanolo sia in mezzi liquidi che solidi. La fluidità della membrana è stata valutata sotto stress da etanolo utilizzando la spettroscopia di fluorescenza con la sonda Laurdan, mentre la microscopia a forza atomica (AFM) è stata utilizzata per analizzare l'integrità superficiale di cellule di lievito coltivate a diverse concentrazioni di etanolo.
I risultati hanno mostrato che i ceppi di S. cerevisiae hanno mantenuto una buona crescita al 10% (v/v) di etanolo, mentre i ceppi non-Saccharomyces hanno mostrato una crescita significativamente ridotta. Al 10% (v/v) di etanolo, la fluidità della membrana è aumentata, soprattutto nei ceppi tolleranti a livelli di etanolo fino al 16% (v/v) e che mostrano prestazioni fermentative superiori. I ceppi meno tolleranti, come quelli appartenenti a T. delbrueckii e M. pulcherrima, hanno mostrato aumenti minori di fluidità. Al 18% (v/v) di etanolo, questi ceppi hanno mostrato marcati cambiamenti nella morfologia superficiale, indicando una maggiore instabilità sotto un elevato stress da etanolo, mentre i ceppi più tolleranti hanno mostrato una morfologia superficiale preservata, suggerendo una maggiore adattabilità.
Questi risultati sono fondamentali per comprendere le caratteristiche di fermentazione, la tolleranza all'etanolo e la risposta dei ceppi in termini di cambiamenti nella fluidità della membrana e nell'integrità superficiale, nonché per selezionare additivi efficaci per applicazioni industriali.
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Abstract
Yeasts have been used in food fermentation since ancient times and are now essential in the industrial production of chemicals, pharmaceuticals, and a wide range of metabolic products, including enzymes, vitamins, capsular polysaccharides, and recombinant DNA compounds. They play a crucial role in biotechnological processes, particularly in alcoholic beverage production, where yeast cells encounter various stress factors during fermentation, such as osmotic stress, temperature fluctuations, nutrient depletion, and the accumulation of metabolites like ethanol.
In this thesis, eleven yeast strains including nine Saccharomyces cerevisiae strains and two non-Saccharomyces strains belonging to Torulaspora delbrueckii and Metschnikowia pulcherrima species were assayed. The strains, commercialised by AEB S.p.A and preserved in the Unimore Microbial Culture Collection (UMCC), were first evaluated through microvinification tests. After fermentation, pH and titratable acidity were measured, and sugars, ethanol, glycerol, and organic acids were quantified using HPLC. Furthermore, in specific microvinification tests, the effects of various commercial additives were investigated.
The study further assessed tolerance of strains to increasing ethanol concentrations in both liquid and solid media. Membrane fluidity was evaluated under ethanol stress using fluorescence spectroscopy with the Laurdan probe, while Atomic Force Microscopy (AFM) was used to analyse the surface integrity of yeast cells grown at different ethanol concentrations.
Results showed that S. cerevisiae strains maintained good growth at 10% (v/v) ethanol, whereas non-Saccharomyces strains displayed significantly reduced growth. At 10% (v/v) ethanol, membrane fluidity increased, especially in strains tolerant to ethanol levels up to 16% (v/v) and exhibiting superior fermentative performance. Less tolerant strains, such as those belonging to T. delbrueckii and M. pulcherrima, showed smaller increases in fluidity. At 18% (v/v) ethanol, these strains exhibited marked changes in surface morphology, indicating greater instability under high ethanol stress, whereas more tolerant strains showed preserved surface morphology, suggesting enhanced adaptability.
These findings are fundamental for understanding the fermentation characteristics, ethanol tolerance, and the response of the strains in terms of changes in membrane fluidity and surface integrity, as well as for selecting effective additives for industrial applications.
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