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I peptidi derivati dal latte possono influenzare specifiche funzioni fisiologiche agendo sulle condizioni di salute del corpo umano. Le bioattività provate sono quelle oppiacee, antiipertensive, immunomodulatorie, antiossidanti, antimicrobiche e di trasporto dei minerali. In questa tesi ho investigato il rilascio di tripeptidi antiipertensivi Valina-Prolina-Prolina (VPP) e Isoleucina-Prolina-Prolina (IPP) a partire dalle caseine del latte sia durante la fermentazione operata da lattobacilli non-starter (NSLAB) che durante la digestione in vitro gastro-intestinale. Nell'esperimento 1, 39 ceppi di NSLAB isolati da diverse fonto sono stati selezionati per l'attività idrolitica delle proteine del latte. Due ceppi dal Parmigiano Reggiano, Lactobacillus casei PRA205 e Lactobacillus rhamnosus PRA331 mostrando il maggiore fenotipo proteolitico sono stati selezionati per fermentare latte vaccino. Il latte fermentato con Lb. casei PRA205 ha mostrato valori maggiori di attività antiossidante (1184.83 ± 40.28 mmol/L trolox equivalenti), ACE inibitoria (IC50= 54.57 mg/mL) e produzione di VPP e IPP. Nell'esperimento 2 ho testato i ceppi precedentemente selezionati per la sopravvivenza ed il rilascio di peptidi antiipertensivi nella fermentazione dello yogurt e relativa frigoconservazione. Il ceppo PRA205 supera il ceppo PRA331 nella sopravvivenza durante la frigoconservazione (28 giorni), portando una carica vitale (>108 CFU/g). Le analisi delle frazioni peptidiche ha rivelato che lo yogurt supplementato con PRA205 mostra quantità più alte di peptidi antiossidanti e contenuto di VPP e IPP rispetto a quello con PRA331 sia a fine fermentazione che durante la conservazione. Queste evidenze sostengono soprattutto l'uso di PRA205 come coltura da aggiungere per produrre yogurt funzionali arricchiti sia di peptidi bioattivi che di cellule vive, che portano effetti benefici sulla salute dell'ospite come probiotici. Nell'esperimento 3 ho investigato i meccanismi coinvolti nell'attività proteolitica di Lb. casei PRA205. Ho attenzionato la proteasi di membrana (CEP) coinvolta nel primo step di proteolisi dell' α- e β-caseina e la pathway di degradazione di VPP e IPP. Ho dimostrato che PRA205 possiede una CEP con espressione azoto-dipendente con un optimum di pH e temperatura di 7 e 30°C. Ho studiato la via di degradazione che coinvolge una aminopeptidasi prolin specifica X prolyl dipeptidil aminopeptidasi PepX. L'estrazione, la purificazione e la caratterizzazione biochimica di PepX ha dimostrato un optimum di temperatura tra 37 e 42°C e di pH tra 6.0 e 7.0. Nell'esperimento 4 ho studiato quantitativamente il rilascio di VPP e IPP durante la digestione in vitro di latte vaccino scremato. Usando il modello digestivo in vitro e la spettrometria di massa, è stato dimostrato per la prima volta che VPP e IPP sono rilasciati anche da enzimi gastro-intestinali. L'analisi in silico dei siti di taglio delle sequenze di caseine contenenti VPP e IPP accoppiate con l'identificazione di precursori mediante spettrometria di massa ha suggerito i possibili enzimi digestivi coinvolti nel rilascio dei tripeptidi. In conclusione, la presente tesi di dottorato contribuisce all'incremento della comprensione delle due diverse vie di rilascio di VPP e IPP dalle caseine mediante il sistema proteolitico dei lattobacilli e gli enzimi gastrointestinali. Nonostante l'approccio in vitro, i miei risultati possono essere sfruttati per pianificare una strategia razionale che combina il sistema proteolitico dei lattobacilli e oro-gastroinstestinale al fine di massimizzare in vivo la dose finale di peptidi antiipertensivi.

Milk-derived peptides may influence specific physiological functions, acting on body health conditions. The proven bioactivities include opiate, antihypertensive, immuno-modulating, antioxidative, antimicrobial, and mineral-carrying activities. In this thesis, I investigated the release of the antihypertensive tripeptides valine-proline-proline (VPP) and isoleucine-proline-proline (IPP) from milk caseins both by non-starter lactobacilli (NSLAB) during dairy fermentation and by digestive enzymes during in vitro oro-gastro-intestinal (OGI) digestion. In experiment 1, 39 NSLAB from different sources were screened for their ability to hydrolyse milk proteins. Two strains from Parmigiano Reggiano, Lactobacillus casei PRA205 and Lactobacillus rhamnosus PRA331, showed the most proteolytic phenotype and were positively selected to ferment cow milk. Milk fermented with Lb. casei PRA205 exhibited the highest radical scavenging (1184.83 ± 40.28 mmol/L trolox equivalents) and ACE-inhibitory (IC50= 54.57 mg/mL) activities, as well as the highest VPP and IPP production. In experiment 2, I tested the previously selected strains for the survivability and the release of antihypertensive and antioxidant peptides in yogurt fermentation and cold storage. Strain PRA205 overcame PRA331 in survivability during cold storage (28 days), leading to viable counts (>108 CFU/g) higher than the minimum probiotic therapeutic threshold (106 CFU/g). Analyses of peptide fractions revealed that yogurt supplemented with PRA205 displayed higher amounts of ACE-inhibitory and antioxidant peptides and higher VPP and IPP content than that produced with PRA331 at the end of fermentation and over storage. Overall, these evidences supported PRA205 as promising adjunct culture for producing bi-functional yogurt enriched in both bioactive peptides and viable cells, which bring health benefits to the host as probiotics. In experiment 3, I investigated the mechanistic underpinnings of proteolytic activity in Lb. casei PRA205. I focused my attention on cell-envelope-proteinase (CEP) involved in the first step of α- and β-casein proteolysis and on VPP and IPP degradation pathway. I demonstrated that PRA205 possesses a CEP which exhibits a nitrogen medium-dependent expression and has the optimum pH and temperature of 7.0 and 30°C, respectively. I studied a VPP and IPP degradation pathway, which entail the proline specific X prolyl dipeptidyl aminopeptidase PepX. Extraction, purification and biochemical characterization of PepX demonstrated that the maximum activity ranges from 37 to 42°C temperature and from 6.0 e 7.0 pH. In experiment 4, I quantitatively studied the release of VPP and IPP during in vitro OGI digestion of bovine skimmed milk. By using the recently developed harmonized static in vitro digestion model and peptide-targeted mass spectrometry, for the first time I demonstrated that VPP and IPP are released by gastro-intestinal proteolytic enzymes . In silico analysis of theoretical cleavage sites in the VPP- or IPP-containing sequences of bovine milk caseins coupled with mass spectrometry identification of precursors suggested that several digestive proteolytic enzymes might be involved in tripeptide release. In conclusion, the present PhD thesis contributes to increase the understanding on two different ways of VPP and IPP release from caseins by lactobacilli proteolytic system and the gastrointestinal digestive enzymes, respectively. Despite arising from in vitro approaches, my results may be exploited to plan a rational strategy, which combines lactobacilli and OGI proteolytic enzymes to maximize the final dose of antihypertensive peptides in vivo.